1. Alamin ang absorbance ng RNA solution
Ang pagsipsip sa 280, 320, 230, at 260 nm ay kumakatawan sa mga halaga ng nucleic acid, background (solusyon labo), konsentrasyon ng asin, at organikong bagay tulad ng protina, ayon sa pagkakabanggit.Sa pangkalahatan, tingnan lamang ang OD260/OD280 (Ratio, R).Kapag 1.8~2.0, iniisip namin na ang kontaminasyon ng protina o iba pang organikong bagay sa RNA ay maaaring tiisin, ngunit dapat tandaan na kapag ginamit ang Tris bilang buffer upang makita ang pagsipsip, ang halaga ng R ay maaaring mas malaki kaysa sa 2 (karaniwan ay dapat na <2.2).Kapag R<1.8, ang polusyon ng protina o iba pang organikong bagay sa solusyon ay mas malinaw, at ang kapalaran ng RNA ay maaaring matukoy ayon sa mga pangangailangan.Kapag R>2.2, nangangahulugan ito na ang RNA ay na-hydrolyzed sa solong nucleic acid.
2.Electrophoric pattern ng RNA
Sa pangkalahatan, ang denaturing gel ay ginagamit para sa RNA electrophoresis, ngunit kung ito ay para lamang sa pag-detect ng kalidad ng RNA, ang denaturing gel ay hindi kinakailangan, at ang ordinaryong agarose gel ay maaaring gamitin.Ang layunin ng electrophoresis ay upang makita ang integridad ng 28S at 18S na mga banda at ang kanilang ratio, o ang integridad ng mRNA smear.Sa pangkalahatan, kung ang 28S at 18S band ay maliwanag, malinaw, at matalas (na tumutukoy sa mga gilid ng mga banda ay malinaw), at ang liwanag ng 28S ay higit sa dalawang beses kaysa sa 18S band, itinuturing namin ang kalidad ng RNA na mabuti.
Ang nasa itaas ay ang dalawang pamamaraan na karaniwang ginagamit namin, ngunit wala sa dalawang pamamaraan na ito ang malinaw na makapagsasabi sa amin kung mayroong natitirang RNase sa solusyon ng RNA.Kung mayroong isang napakaliit na halaga ng RNase sa solusyon, mahirap para sa amin na tuklasin ito sa pamamaraan sa itaas, ngunit ang karamihan sa mga kasunod na reaksyon ng enzymatic ay isinasagawa sa itaas ng 37 degrees at sa mahabang panahon.Sa ganitong paraan, kung mayroong isang napakaliit na halaga ng RNase sa solusyon ng RNA, magkakaroon ng isang napaka-angkop na kapaligiran at oras upang gampanan ang kanilang papel sa mga kasunod na mga eksperimento, at siyempre ang eksperimento ay magiging malamig sa oras na ito.Sa ibaba ay ipinakilala namin ang isang pamamaraan na maaaring kumpirmahin kung mayroong natitirang RNase sa solusyon ng RNA.
3. Pagsubok sa pangangalaga ng init
Ayon sa sample na konsentrasyon, gumuhit ng dalawang 1000 ng RNA mula sa RNA solution at idagdag ito sa isang 0.5 ml centrifuge tube, at dagdagan ito ng pH 7.0 Tris buffer sa kabuuang volume na 10 ul, at pagkatapos ay i-seal ang takip ng tubo.Ilagay ang isa sa mga ito sa isang pare-pareho ang temperatura na paliguan ng tubig sa 70°C at panatilihin itong mainit-init sa loob ng 1 oras.Ang iba pang bahagi ay nakaimbak sa isang -20°C na refrigerator sa loob ng 1 oras.Kapag tapos na ang oras, alisin ang dalawang sample para sa electrophoresis.Matapos makumpleto ang electrophoresis, ihambing ang mga electrophoretic band ng dalawa.Kung ang mga banda ng dalawa ay pare-pareho o walang makabuluhang pagkakaiba (siyempre, ang kanilang mga banda ay nakakatugon din sa mga kondisyon sa pamamaraan 2), nangangahulugan ito na walang natitirang kontaminasyon ng RNase sa solusyon ng RNA, at ang kalidad ng RNA ay napakahusay.Sa kabaligtaran, kung ang sample na incubated sa 70 ° C ay nagpapakita ng malinaw na pagkasira, ipinapahiwatig nito na mayroong kontaminasyon ng RNase sa solusyon ng RNA.
2 Mga eksperimentong pamamaraan at pamamaraan para sa pagkuha ng RNA
Ang mga problemang madalas nating nararanasan sa pag-extract ng RNA ay: (1) mababa ang ani ng RNA;(2) Ang RNA ay may malubhang polusyon sa asin;(3) Ang RNA ay may malubhang organikong solvent na polusyon;(4) sample degradation at iba pang mga problema
1. Karaniwang ginagamit na kabuuang RNA extraction reagents
Ang pamamaraang guanidine isothiocyanate at ang pamamaraang Trizol ay ang pinakakaraniwang ginagamit na pamamaraan para sa pagkuha ng kabuuang RNA mula sa mga tisyu ng hayop at mga selula ng hayop.Ito ay angkop lalo na para sa maliliit na sample at tissue na partikular na mahirap kunin, tulad ng pagkuha ng kabuuang RNA mula sa balat ng kuneho at tissue ng connective ng hayop;bilang karagdagan, ang Trizol, bilang isang pangkalahatang layunin na lysis reagent, ay maaari ding gamitin para sa pagkuha ng mga tisyu ng halaman, bakterya, fungi at iba pang mga tisyu.Para sa mga tisyu ng halaman na naglalaman ng polysaccharides at polyphenols, tulad ng camellia oleifera, dahon ng tsaa, rapeseed, atbp., ang paraan ng CTAB ay maaari ding gamitin upang kunin ang kabuuang RNA.
Bilang isang maginoo na pamamaraan, ang double-column na paraan ay napakapopular din dahil sa normal na operasyon ng temperatura nito, hindi na kailangang magdagdag ng RNase, at kaligtasan—walang chloroform, phenols at iba pang organic reagents para sa pagkuha.(inirerekomendang mga produkto )
2. Pagkuha ng kabuuang RNA mula sa mga tisyu ng hayop
(1) Subukang pumili ng sariwang tissue, kung ito ay hindi sariwa (mas mabuti sa loob ng tatlong buwan - 80 ℃ refrigerator o nagyelo sa likidong nitrogen. Kapag pinuputol ang tissue, huwag direktang gupitin sa temperatura ng silid, siguraduhing Ilagay ito sa kahon ng yelo, subukang maiwasan ang paulit-ulit na pagyeyelo at lasaw.
(2) Gumamit ng malinis na gunting at sipit para gupitin ang isang maliit na piraso ng tissue, subukang gupitin ang gitnang bahagi ng tissue kapag pinuputol ang sample, o gupitin muna ang malaking piraso ng tissue mula sa gitna, at pagkatapos ay gupitin ang sample sa bagong posisyon ng paghiwa.Ang tinanggal na tissue ay dapat na ganap na ginutay-gutay, ilagay ang ginutay-gutay na tissue sa isang EP tube na walang RNase, idagdag ang lysate, ang ginutay-gutay na tissue ay dapat na ganap na nakalantad sa lysate, at maghanda para sa homogenization.
(3) Para sa mga normal na tissue, piliin ang mung bean-sized tissues (30-60 mg) para sa homogenization.Kung ang mga tissue ay naglalaman ng malaking halaga ng protina, taba, o siksik na fibrous tissue tulad ng atay, naaangkop na dagdagan o bawasan ang dami ng mga cut tissue (opsyonal) Pumili ng 10~20 mg).
(4) Kung ang kalamnan ng isda, karne ng hipon, dikya at iba pang mga tisyu na may mataas na nilalaman ng tubig ay nakuha, ang dami ng sample ay dapat na naaangkop na tumaas (inirerekomenda 100-200 mg).
(5) Kung pinahihintulutan ng mga kundisyon, ang tissue ng hayop ay maaaring direktang makuha pagkatapos ma-homogenize gamit ang isang high-passage tissue homogenizer, kung walang ganoong kagamitan.
(6) Ang RNA na nakuha pagkatapos ng panghuling pagkuha ay dapat ilagay kaagad sa kahon ng yelo upang mabawasan ang pagkasira ng RNA.
3. Pagkuha ng animal cell RNA
(1) Suspension cells: direkta sa centrifuge at itapon ang medium, hugasan ng sterile PBS nang 1-2 beses, pagkatapos ay suspindihin gamit ang naaangkop na halaga ng PBS, at pagkatapos ay idagdag ang lysate para sa lysis.Huwag idagdag ang lysate nang direkta sa namuong mga cell pagkatapos ganap na itapon ang likido.Ito ay magiging sanhi ng paglabas ng histone package pagkatapos ng lysed na mga cell sa panlabas na layer na dumikit sa labas ng namuong mga cell, at sa gayon ay nililimitahan ang contact ng mga cell sa loob ng pellet sa lysate., na nagreresulta sa hindi kumpletong cell lysis at nabawasan ang ani ng RNA.
(2) Mga cell na semi-adherent o hindi mahigpit na adherent: Pagkatapos itapon ang medium, hugasan gamit ang PBS nang 1-2 beses, pagkatapos ay direktang sumipsip ng naaangkop na halaga ng PBS at hipan ang culture dish gamit ang pipette o baril para pumutok ang mga cell, at ilipat ang mga ito sa RNA-free na mga cell.Idagdag ang lysate sa EP tube ng enzyme para sa pagkuha.
(3) Adherent cell: kailangang matunaw muna ng trypsin, pagkatapos ay kolektahin sa RNase-free EP tubes, sentripuged para maalis ang supernatant, hugasan ng 1-2 beses gamit ang PBS para maalis ang sobrang trypsin, at muling suspindihin ng naaangkop na halaga ng PBS Pagkatapos ay magpatuloy sa hakbang sa pagkuha.
4. Pagkuha ng RNA ng halaman
Ang mga tissue ng halaman ay mayaman sa mga phenolic compound, o mayaman sa polysaccharides, o naglalaman ng ilang hindi kilalang pangalawang metabolite, o may mataas na aktibidad ng RNase.Ang mga sangkap na ito ay mahigpit na pinagsama sa RNA pagkatapos ng cell lysis upang bumuo ng mga hindi malulutas na complex o colloidal precipitates, na mahirap alisin.Samakatuwid, kapag kinuha namin ang tissue ng halaman, kailangan naming pumili ng isang kit para sa mga halaman.Ang lysate sa kit ay maaaring epektibong malutas ang mga problema ng madaling oksihenasyon ng polyphenols at paghihiwalay ng mga polysaccharide compound at nucleic acid.
(Para sa polysaccharide polyphenol plant RNA extraction, inirerekomendang mga produkto:
(1) Ang alisan ng balat, pulp, buto, dahon, atbp. ng halaman ay dapat na ganap na giling sa isang mortar.Sa panahon ng proseso ng paggiling, ang likidong nitrogen ay dapat na mapunan sa oras upang maiwasan ang pagtunaw ng sample.Ang sample ng lupa ay dapat na mabilis na idagdag sa lysate at inalog upang maiwasan ang pagkasira ng RNA.
(2) Para sa mga sample na mayaman sa hibla tulad ng mga dahon ng bigas at trigo, ang halaga ng pagkuha ay dapat na naaangkop na bawasan, kung hindi, ang tissue grinding at lysis ay hindi magiging kumpleto, na magreresulta sa isang mababang ani ng nakuha na RNA.
(3) Para sa mga tisyu ng halaman na may mataas na nilalaman ng tubig, tulad ng prutas ng granada, prutas ng pakwan, prutas ng peach, atbp., dapat na naaangkop na dagdagan ang laki ng sample (100-200 mg ay opsyonal).
(4) Ang mga tissue ng halaman, tulad ng mga dahon ng halaman, rhizome, matitigas na prutas at iba pang materyales ay karaniwang inirerekomenda na gumamit ng likidong nitrogen upang lubusan na lusong ang mga sangkap sa isang mortar, at pagkatapos ay magpatuloy sa hakbang sa pagkuha.Maaaring hindi epektibo ang mga conventional tissue homogenizer sa pag-homogenize ng mga tissue ng halaman, at sa pangkalahatan ay hindi inirerekomenda.
5. Mga pag-iingat para sa pagkuha ng RNA
(1) Ang mga sample ng tissue ay dapat na sariwa hangga't maaari upang maiwasan ang paulit-ulit na pagyeyelo at pagtunaw.
(2) Ang tissue ay dapat na ganap na giling sa panahon ng pagkuha, at ang dami ng tissue ay hindi dapat masyadong maliit, pabayaan mag-isa masyadong marami.
(3) Ang sapat na oras ng pagpapapisa ng itlog ay dapat ibigay pagkatapos idagdag ang lysate upang ganap na ma-lyse ang sample.
(4) Kapag ginagamit ang paraan ng Trizol para sa pagkuha, ang prinsipyo ng pagsipsip ng supernatant pagkatapos ng stratification ay "mas gustong huminga ng mas kaunti kaysa huminga nang higit pa", at hindi dapat i-extract sa gitnang layer, kung hindi, magdudulot ito ng malubhang genomic DNA contamination.
(5) Kapag naghuhugas, ang washing liquid ay dapat na ganap na nakalusot sa paligid ng tube wall upang matiyak ang masusing paghuhugas.
(6) Para sa paraan ng pagkuha ng column, bilang karagdagan sa pagtanggal ng column pagkatapos ng paghuhugas, ang column ng adsorption ay dapat ding ilagay sa isang ultra-clean na bangko at hipan ng 5-10 minuto upang ganap na sumingaw ang organic solvent hanggang sa pagkatuyo.
(7) Sa huling elution ng column method, pagkatapos magdagdag ng DEPC water, dapat itong i-incubate sa loob ng 3-5 minuto, o ang DEPC na tubig ay dapat painitin sa 60°C nang maaga upang mapataas ang elution yield.Sa tradisyunal na Trizol cleavage at isopropanol precipitation method, ang panghuling RNA ay natunaw sa tubig ng DEPC, kaya ang isang naaangkop na oras ay dapat ibigay para sa dissolution, at ang ilalim ng centrifuge tube ay dapat na patuloy na hinipan ng pipette tip.
3 Three Mga sanhi at solusyon para sa mababang konsentrasyon ng RNA/mahinang kalidad
1. Masyadong mababa ang ani
Ang nakuhang sample ay masyadong mababa, ang kabuuang halaga ay hindi sapat, o ang nakuhang sample ay masyadong marami at ang lysis ay hindi kumpleto;ang tissue o mga cell na may naaangkop na kalidad ay dapat gamitin para sa pagkuha, ang pre-treatment ng sample ay dapat gawin nang maayos, at ang lysis ay dapat sapat.
2. Genome residues
Kapag nag-extract sa pamamagitan ng Trizol method, kapag ang supernatant ay sinipsip sa gitnang layer pagkatapos ng layering, magdudulot ng malubhang genome contamination;ang karagdagang pag-iingat ay dapat gawin kapag nagpapatong upang maiwasan ang pagsuso sa gitnang patong.Kung ang paraan ng hanay ay ginagamit para sa pagkuha, isang kit na naglalaman ng DNase I ay maaaring mapili para sa pagkuha.Ang nucleic acid na na-adsorbed sa lamad ay direktang natutunaw sa DNase I, na maaaring lubos na mabawasan ang mga residue ng DNA.
3. Pagkasira ng RNA
Maaaring ito ay ang pagkasira ng nakuhang sample mismo, o ang pagkasira na dulot ng proseso ng pagkuha;hangga't maaari, ang mga sariwang sample ay dapat gamitin para sa pagkuha ng RNA, at ang mga nakolektang sample ay dapat na nakaimbak sa likidong nitrogen o -80°C na refrigerator sa oras, at dapat na iwasan ang paulit-ulit na pagyeyelo at lasaw.Ang mga libreng tip sa RNase/DNase, centrifuge tube at iba pang materyales ay dapat gamitin sa proseso ng pagkuha ng RNA.Ang proseso ng pagkuha ay dapat na mas mabilis hangga't maaari.Ang nakuhang RNA ay dapat ilagay sa isang kahon ng yelo at nakaimbak sa -80 sa oras.Kung ang nakuhang RNA ay kailangang matukoy ng gel electrophoresis, ang electrophoresis ay dapat isagawa kaagad pagkatapos ng pagkuha, at ang electrophoresis buffer ay dapat mapalitan ng isang bagong handa.
4. Salt at organic solvent residues
Ang mga extraction reagents ay naglalaman ng phenol at guanidine salts, at ang washing solution ay naglalaman ng ethanol.Sa panahon ng proseso ng pagkuha, ang lysate ay hindi ganap na hinihigop at itinapon, at ang solusyon sa paghuhugas ay hindi ganap na natuyo.Ang mga natitirang asing-gamot at mga organikong solvent ay nakakapinsala sa kasunod na reverse transcription at PCR.Iba't ibang antas ng pagsugpo, kaya ang tissue lysate ay dapat na ganap na alisin sa panahon ng proseso ng pagkuha, at ang paghuhugas ay dapat sapat upang ang mga nakapalibot na pader ng tubo ay maaaring hugasan.Bilang karagdagan, ang tubo ay walang laman at hinipan ay isang kinakailangang hakbang, na higit pang mabawasan ang nalalabi ng organikong bagay.
Para sa karagdagang impormasyon tungkol sa pagkuha ng RNA, mangyaring sundan ang aming website:
www.foreivd.com para sa karagdagang impormasyon.
Oras ng post: Dis-01-2022
