Ang ilang mga rebolusyonaryong imbensyon sa kasaysayan ng teknolohiya ng pagtuklas sa aking isipan ay ang immunolabeling na teknolohiya batay sa prinsipyo ng antigen-antibody specific binding, PCR technology at sequencing technology.Ngayon ay pag-uusapan natin ang tungkol sa teknolohiya ng PCR.Ayon sa ebolusyon ng teknolohiya ng PCR, karaniwang hinahati ng mga tao ang teknolohiya ng PCR sa tatlong henerasyon: ordinaryong PCR na teknolohiya, real-time na fluorescent quantitative PCR na teknolohiya at digital PCR na teknolohiya.
Common PCR technique
KARY MULLIS (1944.12.28-2019.8.7)
Inimbento ni Kary Mullis ang polymerase chain reaction (polymerase chain reaction , PCR) noong 1983. Sinasabing noong nagmamaneho siya ng kanyang kasintahan, bigla siyang nagkaroon ng inspirasyon at naisip ang prinsipyo ng PCR (sa mga benepisyo ng pagmamaneho).Si Kary Mullis ay ginawaran ng Nobel Prize sa Chemistry noong 1993. Ang New York Times ay nagkomento: "Highly original and significant, almost dividing biology into pre-PCR and post-PCR era.
Ang prinsipyo ng PCR: Sa ilalim ng catalysis ng DNA polymerase, ang mother strand DNA ay ginagamit bilang template, at ang partikular na panimulang aklat ay ginagamit bilang panimulang punto ng extension, at ang daughter strand DNA na pantulong sa mother strand template DNA ay kinopya sa vitro sa pamamagitan ng denaturation, annealing, extension at iba pang mga hakbang.Ito ay isang DNA synthesis amplification technology in vitro, na maaaring mabilis at partikular na palakasin ang anumang target na DNA sa vitro.
Mga kalamangan ng ordinaryong PCR
1.Klasikong pamamaraan, kumpletong internasyonal at domestic na pamantayan
2.Mas mababang halaga ng mga reagents ng instrumento
3.Maaaring mabawi ang mga produkto ng PCR para sa iba pang mga eksperimento sa molecular biology
Inirerekomendang Foregene PCR machine: https://www.foreivd.com/foreamp-sn-695-series-thermal-cycler-96-wells-pcr-machine-product/
Mga kaugnay na produkto: https://www.foreivd.com/pcr-herotm-with-dye-product/
Mga disadvantages ng ordinaryong PCR
1.madaling marumihan
2.masalimuot na operasyon
3.qualitative analysis lamang
4.Katamtamang sensitivity
5.Mayroong hindi partikular na amplification, at kapag ang hindi partikular na banda ay kapareho ng laki ng target na banda, hindi ito maaaring makilala
Capillary electrophoresis-based PCR
Bilang tugon sa mga pagkukulang ng ordinaryong PCR, ang ilang mga tagagawa ay nagpakilala ng mga instrumento batay sa prinsipyo ng capillary electrophoresis.Ang hakbang ng electrophoresis pagkatapos ng PCR amplification ay nakumpleto sa capillary.Ang sensitivity ay mas mataas, at ang pagkakaiba ng ilang mga base ay maaaring makilala at ang amplification ay maaaring kalkulahin ng MAERKER.nilalaman ng produkto.Ang kawalan ay kailangan pang buksan ang produkto ng PCR at ilagay sa instrumento, at malaki pa rin ang panganib ng kontaminasyon.
CapillaryElectrophoresis
2. Real-time fluorescent quantitative PCR (Quantitative Real-time PCR, qPCR) na teknolohiyaAng Fluorescent quantitative PCR, na tinatawag ding Real-Time PCR, ay isang bagong nucleic acid quantitative na teknolohiya na binuo ng PE (Perkin Elmer) noong 1995. Ang kasaysayan ng pag-unlad ng fluorescent quantitative PCR ay isang kasaysayan ng nakakapukaw ng kaluluwa na pakikibaka ng mga higante tulad ng ABI, Roche, at Bio-Rad.Kung interesado ka, maaari mong tingnan ito.Ang pamamaraan na ito ay kasalukuyang pinaka-mature at malawakang ginagamit na semi-quantitative na pamamaraan ng PCR.
Inirerekomendang qPCR Machine:https://www.foreivd.com/mini-real-time-pcr-system-forequant-sf2sf4-product/
Paraan ng fluorescent dye (SYBR Green I):Ang SYBR Green I ay ang pinakakaraniwang ginagamit na DNA-binding dye para sa quantitative PCR, na hindi partikular na nagbubuklod sa double-stranded na DNA.Sa malayang estado, ang SYBR Green ay naglalabas ng mahinang pag-ilaw, ngunit sa sandaling nakatali sa double-stranded na DNA, ang pag-ilaw nito ay tumataas ng 1000 beses.Samakatuwid, ang kabuuang fluorescent signal na ibinubuga ng isang reaksyon ay proporsyonal sa dami ng double-stranded na DNA na naroroon at tataas sa pagtaas ng amplified na produkto.Dahil hindi partikular na nagbubuklod ang dye sa double-stranded na DNA, maaaring mabuo ang mga maling positibong resulta.
Mga kaugnay na produkto: https://www.foreivd.com/real-time-pcr-easytm-sybr-green-i-kit-product/
Fluorescent probe method (Taqman technology): HabangAng PCR amplification, isang partikular na fluorescent probe ay idinagdag kasabay ng isang pares ng mga primer.Ang probe ay isang linear na oligonucleotide, na may fluorescent reporter group at fluorescent quencher group ayon sa pagkakabanggit na may label sa magkabilang dulo.Kapag ang probe ay buo, ang fluorescent signal na ibinubuga ng reporter group ay hinihigop ng quencher group, at ang detection Walang fluorescent signal;sa panahon ng PCR amplification (sa yugto ng extension), ang 5'-3' Dicer na aktibidad ng Taq enzyme ay digest at magpapababa ng probe, upang ang reporter na fluorescent group at ang quencher fluorescent group ay paghiwalayin, upang ang fluorescence monitoring system Ang fluorescent signal ay matatanggap, iyon ay, sa tuwing ang isang kadena ng DNA ay pinalaki, isang kumpletong fluorescent na molekula ng pag-synchronize ang nabuo sa fluorescent na molekula ng signal at nabubuo ang synchronization ng fluorescent. pagbuo ng mga produktong PCR.Ang pamamaraan ng Taqman probe ay ang pinakakaraniwang ginagamit na paraan ng pagtuklas sa klinikal na pagtuklas.
Mga kaugnay na produkto: https://www.foreivd.com/quickeasy%e1%b5%80%e1%b4%b9-real-time-pcr-kit-taqman-product/
Mga kalamangan ng qPCR
1.Mature na ang pamamaraan at kumpleto na ang mga sumusuportang kagamitan at reagents
2.Katamtamang halaga ng mga reagents
3.madaling gamitin
4.High detection sensitivity at specificity
Mga disadvantages ng qPCR
Ang mutation ng target na gene ay humahantong sa hindi nakuhang pagtuklas.
Ang resulta ng pagtuklas ng template na mababa ang konsentrasyon ay hindi matukoy.
Mayroong malaking error kapag ginagamit ang karaniwang curve para sa quantitative detection.
3. Digital PCR (digital PCR, dPCR) na teknolohiya
Ang Digital PCR ay isang pamamaraan para sa ganap na dami ng mga molekula ng nucleic acid.Kung ikukumpara sa qPCR, direktang mababasa ng digital PCR ang bilang ng mga molekula ng DNA/RNA, na siyang ganap na dami ng mga molekula ng nucleic acid sa panimulang sample.Noong 1999, pormal na iminungkahi nina Bert Vogelstein at Kenneth W. Kin-zler ang konsepto ng dPCR.
Noong 2006, ang Fluidigm ang unang gumawa ng isang komersyal na chip-based na dPCR na instrumento.Noong 2009, inilunsad ng Life Technologies ang OpenArray at QuantStudio 12K Flex dPCR system.Noong 2013, inilunsad ng Life Technologies ang QuantStudio 3DdPCR system, na gumagamit ng high-density nanoscale microfluidic chip technology upang pantay na ipamahagi ang mga sample sa 20,000 indibidwal na mga cell.sa maayos na reaksyon.
Noong 2011, inilunsad ng Bio-Rad ang droplet-based QX100 dPCR instrument, na gumagamit ng water-in-oil na teknolohiya upang pantay na ipamahagi ang sample sa 20,000 droplet-water-in-oil, at gumagamit ng droplet analyzer para suriin ang mga droplet.Noong 2012, inilunsad ng RainDance ang RainDrop dPCR instrument, na hinimok ng high-pressure na gas, upang hatiin ang bawat karaniwang sistema ng reaksyon sa isang reaction emulsion na naglalaman ng 1 milyon hanggang 10 milyong picoliter-level na micro-droplets.
Sa ngayon, ang digital PCR ay nakabuo ng dalawang pangunahing paksyon, uri ng chip at uri ng droplet.Anuman ang uri ng digital PCR, ang mga pangunahing prinsipyo nito ay nililimitahan ang dilution, endpoint PCR at Poisson distribution.Ang karaniwang sistema ng reaksyon ng PCR na naglalaman ng mga template ng nucleic acid ay pantay na nahahati sa sampu-sampung libong mga reaksyon ng PCR, na ipinamamahagi sa mga chips o microdroplets, upang ang bawat reaksyon ay naglalaman hangga't maaari ng isang molekula ng template, at isang solong molekula na template ng reaksyon ng PCR ay ginanap.Sa pamamagitan ng pagbabasa ng fluorescence Ang presensya o kawalan ng signal ay binibilang, at ang absolute quantification ay isinasagawa pagkatapos ng pagkakalibrate ng statistical Poisson distribution.
Ang mga sumusunod ay ang mga katangian ng ilang digital PCR platform na ginamit ko:
1. Bio-Rad QX200 droplet digital PCR Bio-RadAng QX200 ay isang napaka-klasikong digital PCR platform, ang pangunahing proseso ng pagtuklas: 20,000 sample ang nabuo ng droplet generator Ang mga water-in-oil micro-droplets ay pinalakas sa isang ordinaryong PCR machine, at sa wakas ang fluorescence signal ng bawat micro-droplet ay binabasa ng micro-droplet reader.Ang operasyon ay mas kumplikado, at ang panganib ng polusyon ay katamtaman.
Xinyi TD1 micro-droplet digital PCRAng Xinyi TD1 ay isang domestic digital PCR platform, ang pangunahing proseso ng pag-detect: bumuo ng 30,000-50,000 water-in-oil droplets sa pamamagitan ng droplet generator, palakasin sa isang karaniwang PCR instrument, at sa wakas ay pumasa Binabasa ng droplet reader ang fluorescent signal ng bawat droplet.Parehong ginagawa ang droplet generation at pagbabasa sa platform na ito sa isang dedikadong chip na may mababang panganib ng kontaminasyon.
STILLA Naica micro-droplet chip digital PCRAng STILLA Naica ay isang medyo bagong digital PCR platform.Ang pangunahing proseso ng pagtuklas ay: idagdag ang solusyon sa reaksyon sa chip, ilagay ang chip sa micro-droplet generation at amplification system, at bumuo ng 30,000 micro-droplets.Kumalat sa chip, at nakumpleto ang PCR amplification sa chip.Pagkatapos ang amplified chip ay inilipat sa micro-droplet reading analysis system, at ang fluorescent signal ay binabasa sa pamamagitan ng pagkuha ng mga larawan.Dahil ang buong proseso ay nagaganap sa saradong chip, mababa ang panganib ng kontaminasyon.
4. ThermoFisher QuantStudio 3D chip digital PCR
Ang ThermoFisher QuantStudio 3D ay isa pang klasikong chip-based na digital PCR platform.Ang pangunahing proseso ng pagtuklas nito ay: idagdag ang reaction solution sa spreader, at ikalat ang reaction solution nang pantay-pantay sa chip na may 20,000 microwells sa pamamagitan ng spreader., ilagay ang chip sa PCR machine para palakihin, at sa wakas ay ilagay ang chip sa reader at kumuha ng litrato para basahin ang fluorescent signal.Ang operasyon ay medyo kumplikado, at ang buong proseso ay isinasagawa sa isang saradong chip, at ang panganib ng kontaminasyon ay mababa.
5. JN MEDSYS Clarity chip digital PCR
Ang JN MEDSYS Clarity ay isang medyo bagong chip-type na digital PCR platform.Ang pangunahing proseso ng pagtuklas nito ay: idagdag ang reaction solution sa applicator, at ikalat ang reaction solution nang pantay-pantay sa 10,000 PCR tubes na naayos sa PCR tube sa pamamagitan ng applicator.Sa microporous chip, ang reaction solution ay pumapasok sa chip sa pamamagitan ng capillary action, at ang PCR tube na may chip ay inilalagay sa PCR machine para sa amplification, at sa wakas ang chip ay inilalagay sa reader upang basahin ang fluorescent signal sa pamamagitan ng pagkuha ng litrato.Ang operasyon ay mas kumplikado.Ang panganib ng kontaminasyon ay mababa.
Ang mga parameter ng bawat digital PCR platform ay ibinubuod tulad ng sumusunod:
Ang mga tagapagpahiwatig ng pagsusuri ng digital PCR platform ay: ang bilang ng mga split unit, ang bilang ng mga fluorescent channel, ang pagiging kumplikado ng operasyon at ang panganib ng kontaminasyon.Ngunit ang pinakamahalagang bagay ay ang katumpakan ng pagtuklas.Ang isang paraan upang suriin ang mga digital na PCR platform ay ang paggamit ng maraming digital PCR platform upang i-verify ang isa't isa, at ang isa pang paraan ay ang paggamit ng mga karaniwang substance na may mga tumpak na halaga.
Mga kalamangan ng dPCR
1.Pagkamit ng ganap na dami
2.Mas mataas na sensitivity at specificity
3.Maaaring makakita ng mababang mga sample ng kopya
Mga disadvantages ng dPCR1. Mamahaling kagamitan at reagents 2. Kumplikadong operasyon at mahabang oras ng pagtuklas 3. Makitid na hanay ng pagtuklas
Sa kasalukuyan, ang tatlong henerasyon ng teknolohiya ng PCR ay may sariling mga pakinabang at disadvantages, at bawat isa ay may sariling mga larangan ng aplikasyon, at hindi isang relasyon na pinapalitan ng isang henerasyon ang isa pa.Ang patuloy na pag-unlad ng teknolohiya ay nag-inject ng bagong sigla sa teknolohiya ng PCR, na nagbibigay-daan sa pag-unlock ng sunud-sunod na direksyon ng aplikasyon, na ginagawang mas maginhawa at tumpak ang pagtuklas ng nucleic acid.
Pinagmulan: Dinala ka ni Dr. Yuan para sa pagsubok
Mga Inirerekomendang Produkto:
Oras ng post: Nob-18-2022
