• facebook
  • linkedin
  • youtube

Panimulang materyal: RNA

Ang quantitative reverse transcription PCR (RT-qPCR) ay isang pang-eksperimentong paraan na ginagamit sa mga eksperimento sa PCR gamit ang RNA bilang panimulang materyal.Sa pamamaraang ito, ang kabuuang RNA o messenger RNA (mRNA) ay unang na-transcribe sa complementary DNA (cDNA) sa pamamagitan ng reverse transcriptase.Kasunod nito, ang isang reaksyon ng qPCR ay isinagawa gamit ang cDNA bilang isang template.Ginamit ang RT-qPCR sa iba't ibang aplikasyon ng molecular biology, kabilang ang pagsusuri sa expression ng gene, pagpapatunay ng interference ng RNA, pagpapatunay ng microarray, pagtuklas ng pathogen, pagsusuri sa genetic, at pananaliksik sa sakit.

Isang hakbang at dalawang hakbang na pamamaraan para sa RT-qPCR

Maaaring magawa ang RT-qPCR sa pamamagitan ng one-step o two-step na pamamaraan.Pinagsasama ng isang hakbang na RT-qPCR ang reverse transcription at PCR amplification, na nagpapahintulot sa reverse transcriptase at DNA polymerase na kumpletuhin ang reaksyon sa parehong tubo sa ilalim ng parehong mga kondisyon ng buffer.Ang isang hakbang na RT-qPCR ay nangangailangan lamang ng paggamit ng mga primer na partikular sa sequence.Sa dalawang-hakbang na RT-qPCR, ang reverse transcription at PCR amplification ay ginagawa sa dalawang tubo, gamit ang iba't ibang na-optimize na buffer, mga kondisyon ng reaksyon, at mga diskarte sa disenyo ng primer.

Artikulo 1

 

Advantage

Disadvantage

Isang hakbang Ang pamamaraang ito ay may mas kaunting pang-eksperimentong error dahil ang parehong mga reaksyon ay ginagawa sa isang tubo

 

Ang mas kaunting mga hakbang sa pipetting ay nagbabawas sa panganib ng kontaminasyon

 

Angkop para sa high-throughput na amplification/screening, mabilis at maaaring kopyahin

Ang mga dalawang-hakbang na reaksyon ay hindi maaaring i-optimize nang hiwalay

 

Dahil ang mga kondisyon ng reaksyon ay nakompromiso sa pamamagitan ng pagsasama-sama ng dalawang-hakbang na reaksyon, ang sensitivity ay hindi kasing ganda ng sa dalawang-hakbang na pamamaraan.

 

Ang bilang ng mga target na nakita ng isang sample ay maliit

Dalawang Hakbang Kakayahang lumikha ng mga matatag na aklatan ng cDNA na maaaring maimbak sa mahabang panahon at magamit sa maraming reaksyon

 

Ang mga target na gene at reference na gene ay maaaring palakihin mula sa parehong cDNA library nang hindi nangangailangan ng maramihang cDNA library

 

Mga buffer ng reaksyon at kundisyon ng reaksyon na nagbibigay-daan sa pag-optimize ng solong pagtakbo ng reaksyon

 

Nababaluktot na pagpili ng mga kundisyon sa pag-trigger

Ang paggamit ng maraming tubo, at higit pang mga hakbang sa pag-pipet ay nagpapataas ng panganib ng kontaminasyon ng DNA,

at umuubos ng oras.

 

Nangangailangan ng higit pang pag-optimize kaysa sa one-step na paraan

Kaugnay na Mga Produkto:

RT-qPCR Easyᵀᴹ (Isang Hakbang)-SYBR Green I

RT-qPCR Easyᵀᴹ (Isang Hakbang)-Taqman

RT Easyᵀᴹ I Master Premix Para sa First-Strand CDNA Synthesis

Real Time PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit

Real Time PCR Easyᵀᴹ-Taqman

Pagpili ng kabuuang RNA at mRNA

Kapag nagdidisenyo ng eksperimento sa RT-qPCR, mahalagang magpasya kung gagamit ng kabuuang RNA o purified mRNA bilang template para sa reverse transcription.Bagama't ang mRNA ay maaaring makapagbigay ng bahagyang mas mataas na sensitivity, ang kabuuang RNA ay madalas pa ring ginagamit.Ang dahilan nito ay ang kabuuang RNA ay may mas mahalagang kalamangan bilang panimulang materyal kaysa sa mRNA.Una, ang proseso ay nangangailangan ng mas kaunting mga hakbang sa pagdalisay, na nagsisiguro ng mas mahusay na quantitative recovery ng template at mas mahusay na normalisasyon ng mga resulta sa pagsisimula ng mga cell number.Pangalawa, iniiwasan nito ang hakbang sa pagpapayaman ng mRNA, na maaaring maiwasan ang posibilidad ng mga skewed na resulta dahil sa iba't ibang pagbawi ng iba't ibang mRNA.Sa pangkalahatan, dahil sa karamihan ng mga aplikasyon ang kamag-anak na dami ng target na gene ay mas mahalaga kaysa sa ganap na sensitivity ng pagtuklas, ang kabuuang RNA ay mas angkop sa karamihan ng mga kaso.

Reverse transcription primer

Sa dalawang-hakbang na pamamaraan, tatlong magkakaibang pamamaraan ang maaaring gamitin upang i-prime ang cDNA reaction: oligo(dT) primers, random primers, o sequence-specific primers.Karaniwan, ang mga panimulang aklat ng oligo(dT) at mga random na panimulang aklat ay ginagamit sa kumbinasyon.Ang mga primer na ito ay sumasama sa template mRNA strand at nagbibigay ng reverse transcriptase na may panimulang punto para sa synthesis.

artikulo2

Pagpili ng panimulang aklat Istraktura at pag-andar Advantage Disadvantage
Oligo(dT) primer (o anchored oligo(dT) primer) Extended annealing sa thymine residues sa poly(A) tail ng mRNA;Ang anchor oligo(dT) primer ay naglalaman ng G, C, o A sa 3′ dulo (anchor site) Synthesis ng full-length na cDNA mula sa poly(A)-tailed mRNA

 

Naaangkop kapag mas kaunting panimulang materyal ang magagamit

 

Tinitiyak ng anchoring site na ang oligo(dT) primer ay nagbubuklod sa 5′ poly(A) tail ng mRNA

Angkop lamang para sa pagpapalakas ng mga gene na may poly(A) tails

 

Kunin ang cDNA na pinutol mula sa priming site*2 sa poly(A)

 

May kinikilingang magbigkis sa 3′ dulo*

 

*Maliit ang posibilidad na ito kung gagamitin ang mga naka-angkla na oligo(dT) na primer

random na panimulang aklat

 

6 hanggang 9 na base ang haba, na maaaring mag-anneal sa maraming mga site sa panahon ng RNA transcription Anneal sa lahat ng RNA (tRNA, rRNA, at mRNA)

 

Angkop para sa mga transcript na may makabuluhang pangalawang istraktura, o kapag mas kaunting panimulang materyal ang magagamit

 

Mataas na CDNA Yield

Ang cDNA ay reverse transcribe mula sa lahat ng RNA, na kadalasang hindi ninanais at maaaring maghalo ng signal ng target na mRNA

 

maputol ang cDNA

mga panimulang aklat na tukoy sa pagkakasunud-sunod Mga custom na primer na nagta-target ng mga partikular na sequence ng mRNA tiyak na library ng cDNA

 

Pagbutihin ang pagiging sensitibo

 

Paggamit ng reverse qPCR primers

Limitado lamang sa synthesis ng isang target na gene

Baliktarin ang transcriptase

Ang reverse transcriptase ay isang enzyme na gumagamit ng RNA upang i-synthesize ang DNA.Ang ilang mga reverse transcriptases ay may aktibidad na RNase at maaaring pababain ang mga RNA strand sa RNA-DNA hybrid strands pagkatapos ng transkripsyon.Kung wala itong aktibidad na enzymatic ng RNase, maaaring idagdag ang RNaseH para sa mas mataas na kahusayan ng qPCR.Kasama sa mga karaniwang ginagamit na enzyme ang Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase at avian myeloblastoma virus reverse transcriptase.Para sa RT-qPCR, mainam na pumili ng isang reverse transcriptase na may mas mataas na thermostability, upang ang cDNA synthesis ay maisagawa sa mas mataas na temperatura, na tinitiyak ang matagumpay na transkripsyon ng mga RNA na may mas mataas na pangalawang istraktura, habang pinapanatili ang kanilang buong aktibidad sa buong reaksyon, na nagreresulta sa mas mataas na cDNA yield.

Kaugnay na Mga Produkto:

Foreasy M-MLV Reverse Transcriptase

Ang aktibidad ng RNase H ng reverse transcriptase

Nagagawa ng RNaseH na pababain ang RNA strands mula sa RNA-DNA duplexes, na nagbibigay-daan sa mahusay na synthesis ng double-stranded DNA.Gayunpaman, kapag gumagamit ng mahabang mRNA bilang isang template, ang RNA ay maaaring masira nang maaga, na nagreresulta sa naputol na cDNA.Samakatuwid, madalas na kapaki-pakinabang na mabawasan ang aktibidad ng RNaseH sa panahon ng pag-clone ng cDNA kung nais ang synthesis ng mahabang transcript.Sa kaibahan, ang mga reverse transcriptases na may aktibidad na RNase H ay madalas na kapaki-pakinabang para sa mga aplikasyon ng qPCR dahil pinapahusay nila ang pagtunaw ng mga duplex ng RNA-DNA sa unang cycle ng PCR.

Pangunahing disenyo

Ang mga PCR primer na ginamit para sa qPCR step sa RT-qPCR ay dapat na mainam na idinisenyo upang sumasaklaw sa isang exon-exon junction, kung saan ang isang amplification primer ay maaaring potensyal na sumasaklaw sa isang aktwal na hangganan ng exon-intron.Dahil hindi pinapalaki ang mga sequence ng genomic DNA na naglalaman ng intron, binabawasan ng disenyong ito ang panganib ng mga maling positibong pinalaki mula sa kontaminasyon ng genomic DNA.

Kung ang mga primer ay hindi idinisenyo upang paghiwalayin ang mga hangganan ng exon o exon-exon, maaaring kailanganin na tratuhin ang mga sample ng RNA na may RNase-free DNase I o dsDNase upang alisin ang genomic DNA contamination.

Kontrol ng RT-qPCR

Ang isang reverse transcription negative control (-RT control) ay dapat isama sa lahat ng RT-qPCR na eksperimento para makita ang kontaminasyon ng DNA (gaya ng genomic DNA o PCR na mga produkto mula sa mga nakaraang reaksyon).Ang kontrol na ito ay naglalaman ng lahat ng mga sangkap ng reaksyon maliban sa reverse transcriptase.Dahil ang reverse transcription ay hindi nangyayari sa kontrol na ito, kung ang PCR amplification ay sinusunod, ang kontaminasyon mula sa DNA ay malamang.


Oras ng post: Ago-02-2022