• Ang PCR ay isang paraan na ginagamit upang palakihin ang DNA mula sa isang maliit na halaga ng template ng DNA.Gumagamit ang RT-PCR ng reverse transcription upang makagawa ng template ng DNA mula sa isang RNA source na maaaring palakihin.
• Ang PCR at RT-PCR ay karaniwang mga endpoint na reaksyon, habang ang qPCR at RT-qPCR ay gumagamit ng mga kinetics ng rate ng synthesis ng produkto sa panahon ng reaksyon ng PCR upang ma-quantitate ang dami ng template na naroroon.
• Ang mga bagong pamamaraan, tulad ng digital PCR, ay nagbibigay ng ganap na dami ng paunang DNA template, habang ang mga pamamaraan tulad ng isothermal PCR ay nagpapababa ng pangangailangan para sa mamahaling kagamitan upang makapagbigay ng maaasahang mga resulta.

Ang polymerase chain reaction (PCR) ay isang medyo simple at malawakang ginagamit na molecular biology technique upang palakihin at makita ang mga sequence ng DNA at RNA.Kung ikukumpara sa mga tradisyunal na paraan ng pag-clone at amplification ng DNA, na kadalasang tumatagal ng mga araw, ang PCR ay nangangailangan lamang ng ilang oras.Ang PCR ay lubos na sensitibo at nangangailangan ng kaunting template para sa pagtuklas at pagpapalakas ng mga partikular na pagkakasunud-sunod.Ang mga pangunahing pamamaraan ng PCR ay higit pang sumulong mula sa simpleng pagtuklas ng DNA at RNA.Sa ibaba, nagbigay kami ng pangkalahatang-ideya ng iba't ibang paraan ng PCR at mga reagents na ibinibigay namin sa Enzo Life Sciences para sa iyong mga pangangailangan sa pananaliksik.Layunin naming tulungan ang mga siyentipiko na mabilis na ma-access ang mga PCR reagents na gagamitin sa kanilang susunod na proyekto sa pananaliksik!

PCR

Para sa karaniwang PCR, ang kailangan mo lang ay isang DNA polymerase, magnesium, nucleotides, primers, ang DNA template na ipapalaki, at isang thermocycler.Ang mekanismo ng PCR ay kasing simple ng layunin nito: 1) ang double-stranded DNA (dsDNA) ay heat denatured, 2) ang mga primer ay nakahanay sa iisang DNA strands, at 3) ang mga primer ay pinalawak ng DNA polymerase, na nagreresulta sa dalawang kopya ng orihinal na DNA strand.Ang proseso ng denaturation, annealing, at elongation sa isang serye ng mga temperatura at oras ay kilala bilang isang cycle ng amplification (Fig. 1).

Ang bawat hakbang ng cycle ay dapat na ma-optimize para sa template at primer set na ginamit.Ang cycle na ito ay paulit-ulit ng humigit-kumulang 20-40 beses, at ang amplified na produkto ay maaaring masuri, kadalasan sa pamamagitan ng agarose gel (Larawan 2).

Dahil ang PCR ay isang napakasensitibong pamamaraan at napakaliit na volume ay kinakailangan para sa mga solong reaksyon, ang paghahanda ng isang master mix para sa ilang mga reaksyon ay inirerekomenda.Ang master mix ay dapat na maayos na pinaghalo at pagkatapos ay hatiin sa bilang ng mga reaksyon, na tinitiyak na ang bawat reaksyon ay maglalaman ng parehong dami ng enzyme, dNTP, at mga primer.Maraming mga supplier, gaya ng Enzo Life Sciences, ang nag-aalok din ng mga PCR mix na naglalaman na ng lahat maliban sa mga primer at DNA template.

Ang mga rehiyong mayaman sa Guanine/Cytosine (mayaman sa GC) ay kumakatawan sa isang hamon sa mga karaniwang pamamaraan ng PCR.Ang mga sequence na mayaman sa GC ay mas matatag kaysa sa mga sequence na may mas mababang nilalaman ng GC.Higit pa rito, ang mga sequence na mayaman sa GC ay may posibilidad na bumuo ng mga pangalawang istruktura, tulad ng mga hairpin loop.Bilang resulta, mahirap ganap na paghiwalayin ang mga double strand na mayaman sa GC sa yugto ng denaturation.Dahil dito, hindi maaaring synthesize ng DNA polymerase ang bagong strand nang walang hadlang.Ang isang mas mataas na temperatura ng denaturation ay maaaring mapabuti ito, at ang mga pagsasaayos patungo sa isang mas mataas na temperatura ng pagsusubo at mas maikling oras ng pagsusubo ay maaaring maiwasan ang hindi tiyak na pagbubuklod ng mga primer na mayaman sa GC.Maaaring mapahusay ng mga karagdagang reagents ang pagpapalakas ng mga sequence na mayaman sa GC.Ang DMSO, glycerol, at betaine ay nakakatulong na guluhin ang mga pangalawang istruktura na sanhi ng mga pakikipag-ugnayan ng GC at sa gayon ay mapadali ang paghihiwalay ng mga double strand.

Hot Start PCR

Ang hindi tiyak na amplification ay isang problema na maaaring mangyari sa panahon ng PCR.Karamihan sa mga DNA polymerase na ginagamit para sa PCR ay pinakamahusay na gumagana sa mga temperatura sa paligid ng 68°C hanggang 72°C.Gayunpaman, ang enzyme ay maaari ding maging aktibo sa mas mababang temperatura, bagaman sa mas mababang antas.Sa mga temperatura na mas mababa sa temperatura ng annealing, ang mga primer ay maaaring magbigkis nang hindi partikular at humantong sa hindi partikular na amplification, kahit na ang reaksyon ay naka-set up sa yelo.Maiiwasan ito sa pamamagitan ng paggamit ng mga polymerase inhibitors na humihiwalay mula sa DNA polymerase kapag naabot lamang ang isang tiyak na temperatura, kaya ang terminong hot start PCR.Ang inhibitor ay maaaring isang antibody na nagbubuklod sa polymerase at nagde-denatur sa paunang temperatura ng denaturation (karaniwang 95°C).

High Fidelity Polymerase

Habang ang mga polymerase ng DNA ay lumalakas nang medyo tumpak sa orihinal na pagkakasunud-sunod ng template, maaaring mangyari ang mga pagkakamali sa pagtutugma ng nucleotide.Ang mga hindi pagtutugma sa mga application tulad ng pag-clone ay maaaring magresulta sa mga naputol na transcript, at maling pagsasalin o hindi aktibong mga protina sa ibaba ng agos.Upang maiwasan ang mga hindi pagkakatugmang ito, ang mga polymerase na may aktibidad na "proofreading" ay natukoy at isinama sa daloy ng trabaho.Ang unang proofreading polymerase, Pfu, ay nakilala noong 1991 sa Pyrococcus furiosus.Ang Pfu enzyme na ito ay may 3' hanggang 5' exonuclease na aktibidad.Habang pinapalaki ang DNA, inaalis ng exonuclease ang mga hindi tugmang nucleotide sa 3' dulo ng strand.Ang tamang nucleotide ay pinapalitan, at ang DNA synthesis ay nagpapatuloy.Ang pagkakakilanlan ng mga maling pagkakasunud-sunod ng nucleotide ay batay sa nagbubuklod na affinity para sa tamang nucleoside triphosphate sa enzyme, kung saan ang hindi mahusay na pagbubuklod ay nagpapabagal sa synthesis at nagbibigay-daan para sa tamang pagpapalit.Ang aktibidad ng proofreading ng Pfu polymerase ay nagreresulta sa mas kaunting mga error sa huling pagkakasunud-sunod kumpara sa Taq DNA polymerase.Sa mga nagdaang taon, ang iba pang mga proofreading enzymes ay natukoy, at ang mga pagbabago sa orihinal na Pfu enzyme ay ginawa upang higit pang bawasan ang error rate sa panahon ng DNA amplification.

RT-PCR

Ang reverse transcription PCR, o RT-PCR, ay nagbibigay-daan sa paggamit ng RNA bilang template.Ang isang karagdagang hakbang ay nagbibigay-daan sa pagtuklas at pagpapalakas ng RNA.Ang RNA ay reverse transcribe sa complementary DNA (cDNA), gamit ang reverse transcriptase.Ang kalidad at kadalisayan ng template ng RNA ay mahalaga para sa tagumpay ng RT-PCR.Ang unang hakbang ng RT-PCR ay ang synthesis ng isang DNA/RNA hybrid.Ang reverse transcriptase ay mayroon ding RNase H function, na nagpapababa sa bahagi ng RNA ng hybrid.Ang single-stranded na molekula ng DNA ay kinukumpleto ng DNA-dependent na DNA polymerase na aktibidad ng reverse transcriptase sa cDNA.Ang kahusayan ng unang-strand na reaksyon ay maaaring makaapekto sa proseso ng amplification.Mula dito, ang karaniwang pamamaraan ng PCR ay ginagamit upang palakasin ang cDNA.Ang posibilidad na ibalik ang RNA sa cDNA sa pamamagitan ng RT-PCR ay may maraming mga pakinabang, at ito ay pangunahing ginagamit para sa pagsusuri ng expression ng gene.Ang RNA ay single-stranded at napaka-unstable, na ginagawang mahirap gamitin.Karaniwan itong nagsisilbing unang hakbang sa qPCR, na binibilang ang mga transcript ng RNA sa isang biological sample.

qPCR at RT-qPCR

Ang quantitative PCR (qPCR) ay ginagamit upang tuklasin, kilalanin at i-quantify ang mga nucleic acid para sa maraming aplikasyon.Sa RT-qPCR, ang mga transcript ng RNA ay madalas na binibilang sa pamamagitan ng reverse transcribe sa kanila sa cDNA muna, tulad ng inilarawan sa itaas, at pagkatapos ay isinasagawa ang qPCR.Tulad ng sa karaniwang PCR, ang DNA ay pinalalakas ng tatlong paulit-ulit na hakbang: denaturation, annealing, at elongation.Gayunpaman, sa qPCR, ang fluorescent labeling ay nagbibigay-daan sa pagkolekta ng data habang umuusad ang PCR.Ang pamamaraan na ito ay may maraming mga benepisyo dahil sa hanay ng mga pamamaraan at chemistries na magagamit.

Sa qPCR na nakabatay sa dye (karaniwang berde), pinahihintulutan ng fluorescent na label ang pag-quantification ng mga amplified na molekula ng DNA sa pamamagitan ng paggamit ng isang dsDNA binding dye.Sa bawat cycle, sinusukat ang fluorescence.Ang signal ng fluorescence ay tumataas nang proporsyonal sa dami ng na-replicated na DNA.Samakatuwid, ang DNA ay binibilang sa "real-time" (Fig. 3).Ang mga disadvantages sa qPCR na nakabatay sa dye ay isang target lamang ang maaaring suriin sa isang pagkakataon at ang dye ay magbubuklod sa anumang ds-DNA na nasa sample.

Sa qPCR na nakabatay sa probe, maraming target ang maaaring makita nang sabay-sabay sa bawat sample, ngunit nangangailangan ito ng pag-optimize at disenyo ng (mga) probe na partikular sa target na ginagamit bilang karagdagan sa mga primer.Mayroong ilang mga uri ng disenyo ng probe, ngunit ang pinakakaraniwang uri ay isang hydrolysis probe, na may kasamang fluorophore at quencher.Pinipigilan ng fluorescence resonance energy transfer (FRET) ang paglabas ng fluorophore sa pamamagitan ng quencher habang ang probe ay buo.Gayunpaman, sa panahon ng reaksyon ng PCR, ang probe ay na-hydrolyzed sa panahon ng pagpapalawak ng panimulang aklat at pagpapalakas ng tiyak na pagkakasunud-sunod na ito ay nakasalalay.Ang cleavage ng probe ay naghihiwalay sa fluorophore mula sa quencher at nagreresulta sa isang pagtaas na umaasa sa amplification sa fluorescence (Fig. 4).Kaya, ang fluorescence signal mula sa isang probe-based na qPCR reaction ay proporsyonal sa dami ng probe target sequence na naroroon sa sample.Dahil ang probe-based na qPCR ay mas tiyak kaysa sa dye-based na qPCR, ito ang kadalasang teknolohiyang ginagamit sa qPCR-based na diagnostic assays.

Isothermal Amplification

Ang mga teknik na binanggit sa PCR sa itaas ay nangangailangan ng mamahaling kagamitan sa thermocycling upang tumpak na mapataas at pababa ang mga temperatura ng chamber para sa mga hakbang sa denaturation, annealing, at extension.Ang isang bilang ng mga diskarte ay binuo na hindi nangangailangan ng gayong tumpak na mga aparato at maaaring gawin sa isang simpleng paliguan ng tubig o kahit na sa loob ng mga cell ng interes.Ang mga diskarteng ito ay sama-samang tinatawag na isothermal amplification at gumagana batay sa exponential, linear, o cascade amplification.

Ang pinakakilalang uri ng isothermal amplification ay loop-mediated isothermal amplification, o LAMP.Gumagamit ang LAMP ng exponential amplification sa 65⁰C para palakasin ang template na DNA o RNA.Kapag nagsasagawa ng LAMP, apat hanggang anim na panimulang panimulang pantulong sa mga rehiyon ng target na DNA ay ginagamit na may DNA polymerase upang mag-synthesize ng bagong DNA.Dalawa sa mga primer na ito ay may mga komplimentaryong pagkakasunud-sunod na kumikilala sa mga pagkakasunud-sunod sa iba pang mga panimulang aklat at nagbibigkis sa mga ito, na nagbibigay-daan para sa isang "loop" na istraktura na mabuo sa bagong synthesize na DNA na pagkatapos ay tumutulong sa primer na pagsusubo sa mga susunod na round ng amplification.Ang LAMP ay maaaring makita sa pamamagitan ng maraming pamamaraan, kabilang ang fluorescence, agarose gel electrophoresis, o colorimetry.Ang kadalian ng pag-visualize at pag-detect ng presensya o kawalan ng produkto sa pamamagitan ng colorimetry at ang kakulangan ng mamahaling kagamitan ay ginawang angkop na opsyon ang LAMP para sa pagsusuri sa SARS-CoV-2 sa mga lugar kung saan hindi madaling makuha ang clinical lab testing, o imbakan at transportasyon ng mga sample ay hindi magagawa, o sa mga lab na dati ay walang PCR thermocycling equipment.