Ang pag-verify sa pagganap ng mga panimulang aklat at probe sa maagang yugto ng mga PCR reagents at pagtukoy ng mga pinaka-angkop na kondisyon ng reaksyon ay ang mga kinakailangan upang matiyak ang maayos na pag-unlad ng mga pormal na eksperimento.
Kaya paano natin kailangang kumpirmahin ang panimulang pagsisiyasat sa maagang yugto?
Ang mga pangunahing indicator ay baseline, amplification curve, ct value, amplification efficiency, low-concentration sample detection, CV, atbp.
Baseline
Ang baseline ay ang pahalang na linya sa PCR amplification curve.Sa unang ilang mga cycle ng PCR amplification reaction, ang fluorescence signal ay hindi gaanong nagbabago at bumubuo ng isang tuwid na linya.Ang tuwid na linyang ito ay ang baseline.
Kapag nagsa-screen ng PCR primer probe, bigyang pansin kung ang baseline ay antas.Ang kadalisayan ng konsentrasyon ng panimulang probe ay makakaapekto sa baseline, tulad ng sanhi ng pagtaas o pagbaba ng baseline.Ang baseline ay isa ring napaka-intuitive na tagapagpahiwatig.
Amplification Curve
Ang isa pang intuitive indicator ay ang hugis ng amplification curve.Pinakamainam na magkaroon ng isang hugis-S na kurba upang maiwasan ang pangalawang amplification o iba pang abnormal na mga kurba ng amplification.
Halaga ng Ct
Ang bilang ng mga cycle na tumutugma sa inflection point mula sa baseline hanggang sa exponential growth ay ang Ct value.
Para sa parehong sample, ang iba't ibang mga panimulang probe ay nagreresulta sa iba't ibang mga curve ng amplification, at ang katumbas na halaga ng Ct ay maaapektuhan ng kahusayan ng amplification at interference degree.Sa teorya, mas maliit ang Ct value ng primer probe na pipiliin natin, mas mabuti.
Kahusayan sa Pagpapalakas
Ang isa sa mga pinaka-maaasahan at matatag na pamamaraan para sa pagsusuri ng kahusayan ng PCR amplification ay ang karaniwang curve, na malawak ding kinikilala ng mga mananaliksik.Ang pamamaraan ay nagsasangkot ng paggawa ng isang serye ng mga sample upang makontrol ang kaugnay na bilang ng mga target na template.Ang mga sample na ito ay karaniwang ginagawa sa pamamagitan ng mga serial dilution ng concentrated stock solutions, ang pinakakaraniwang ginagamit ay 10-fold dilution.Gamit ang isang serye ng mga diluted sample, gamit ang standard na qPCR program para palakihin para makuha ang Cq value, at sa wakas ay gumuhit ng standard curve ayon sa konsentrasyon ng bawat sample at ang katumbas na Cq value para makuha ang linear equation Cq= -klgX0+b, at ang amplification efficiency E=10(-1 /k)-1.Kapag gumagamit ng qPCR para sa quantitative analysis, ang kahusayan sa amplification ay kinakailangang nasa hanay na 90%-110% (3.6>k>3.1).
Detection ng Mga Sample na may mababang konsentrasyon
Kapag ang sample na konsentrasyon ay mababa, ang mga rate ng pagtuklas ng iba't ibang panimulang probe ay iba.Pumili kami ng 20 sample na mababa ang konsentrasyon upang kopyahin, at ang primer-probe system na may pinakamataas na rate ng pagtuklas ay ang pinakamahusay.
Coefficient of Variation (CV)
Ang 10 duplicate na sample ay maaaring makita gamit ang iba't ibang primer probes ayon sa line standard ng reagent para sa nucleic acid amplification detection.
Dami na Reagents:
Katumpakan
Ang katumpakan sa loob ng isang batch ay dapat matugunan: ang koepisyent ng pagkakaiba-iba (CV,%) ng logarithmic na halaga ng konsentrasyon ng pagsubok ay ≤5%.Kapag mababa ang sample na konsentrasyon, ang coefficient of variation (CV,%) ng logarithm ng detection concentration ay ≤10%
Mga qualitative reagents:
Katumpakan
Ang katumpakan sa loob ng isang batch ay dapat matugunan:
(1) Coefficient ng variation ng Ct value (CV,%) ≤5%
Ang parehong sample ay sinusuri nang magkatulad sa loob ng 10 beses, at ang mga resulta ng pagsubok ay dapat na pare-pareho
Oras ng post: Set-18-2021
