Naniniwala ako na ang lahat ay palaging makakatagpo ng ganito o ganoong mga problema kapag gumagawa ng mga reaksyon ng PCR, ngunit karamihan sa mga ito ay maaaring mauri sa dalawang pangunahing problema:

Masyadong maliit na amplification ng gene template (amplification);
Masyadong maraming non-target na gene amplification.
Ang paggamit ng mga additives ay isa sa mga karaniwang diskarte upang malutas ang mga problemang ito.Karaniwan ang papel ng mga additives ay may dalawang aspeto:
pangalawang istrakturang mga gene (pangalawang istraktura);
Bawasan ang di-tiyak na priming.
Ngayon, maikling ipapakilala sa iyo ng editor ang mga karaniwang additives sa mga reaksyon ng PCR at ang kanilang mga function.
Mga additives na nagpapababa ng pangalawang istraktura
sulfoxide(DMSO)
mga sample ng genena may mataas na nilalaman ng GC.Gayunpaman, lubos ding binabawasan ng DMSO ang aktibidad ng Taq polymerase.Samakatuwid, kailangang balansehin ng lahat ang pagiging naa-access ng template at ang aktibidad ng polymerase.Iminumungkahi ng editor na maaari mong subukan ang iba't ibang konsentrasyon ng DSMO, tulad ng mula 2% hanggang 10%, upang mahanap ang konsentrasyon na nababagay sa iyong eksperimento.
Mga non-ionic na detergent
Ang mga non-ionic detergent, tulad ng 0.1-1% Triton X-100, Tween 20 o NP-40, ay kadalasang binabawasan ang pangalawang istraktura ng DNA.Bagama't maaari nitong palakihin ang amplification ng template gene, magdudulot din ito ng problema sa hindi partikular na amplification.Kaya, ang mga additives na ito ay mahusay na gumagana para sa mababang ani na mga reaksyon ng PCR na walang mga labi, ngunit hindi maganda para sa medyo hindi malinis na reaksyon ng PRC.Ang isa pang benepisyo ng non-ionic detergent ay ang pagbabawas ng kontaminasyon ng SDS.Karaniwan sa panahon ng proseso ng pagkuha ng DNA, dadalhin ang SDS sa hakbang ng PCR, na lubos na pumipigil sa aktibidad ng polymerase.Samakatuwid, ang pagdaragdag ng 0.5% Tween-20 o Tween-40 sa reaksyon ay maaaring neutralisahin ang mga negatibong epekto ng SDS.
Betaine_
Maaaring pahusayin ng Betaine ang DNA amplification sa pamamagitan ng pagbabawas ng pangalawang pagbuo ng istraktura at sa pangkalahatan ay isang "misteryo" na karagdagan sa mga komersyal na PCR kit.Kung gusto mong gumamit ng betaine, dapat mong ilagay ang betaine o betaine mono-hydrate (Betaine o Betaine mono-hydrate), ngunit hindi betaine hydrochloride (Betaine HCl), i-adjust sa panghuling konsentrasyon na 1-1.7M.Makakatulong din ang Betaine na pahusayin ang pagiging tiyak dahil inaalis nito ang pagdepende sa komposisyon ng pares ng base ng DNA melting/DNA denaturation.
Mga additives upang bawasan ang di-tiyak na priming
Formamide
Ang Formamide ay isang karaniwang ginagamit na organic na PCR additive.Maaari itong pagsamahin sa major groove at minor groove sa DNA, sa gayon ay binabawasan ang katatagan ng master DNA double helix at pinababa ang temperatura ng pagkatunaw ng DNA.Ang konsentrasyon ng formamide na ginagamit sa mga eksperimento sa PCR ay karaniwang 1%-5%.
Tetramethylammonium chloride( TMAC)
Maaaring pataasin ng Tetramethylammonium chloride ang pagtitiyak ng hybridization (pagtitiyak ng hybridization) at pataasin ang temperatura ng pagkatunaw ng DNA.Kaya, maaaring alisin ng TMAC ang di-tiyak na priming at bawasan ang maling pagkakatali ng DNA at RNA.Kung gagamitin modegenerate primerssa reaksyon ng PCR, tandaan na magdagdag ng TMAC, na karaniwang ginagamit sa konsentrasyon na 15-100mM.
Iba pang Karaniwang Additives
Bilang karagdagan sa dalawang kategorya ng mga additives na nabanggit sa itaas, mayroong maraming mga karaniwang additives sa mga reaksyon ng PCR, bagaman mayroon silang iba't ibang mga pag-andar, ang mga ito ay napakahalaga din.
Magnesium ion
Ang Magnesium ion ay isang kailangang-kailangan na cofactor (cofactor) ng polymerase, ibig sabihin, kung walang magnesium ion, ang polymerase ay hindi aktibo.Gayunpaman, ang sobrang magnesium ions ay maaari ding makaapekto sa kahusayan ng polymerase.Mag-iiba ang konsentrasyon ng magnesium ions sa bawat PCR reaction.Ang mga chelating agent (tulad ng EDTA o citrate), ang konsentrasyon ng mga dNTP at protina ay lahat ay nakakaapekto sa konsentrasyon ng mga magnesium ions.Kaya, kung mayroon kang mga problema sa iyong eksperimento sa PCR, maaari mong subukang baguhin ang iba't ibang mga konsentrasyon ng magnesium ion, halimbawa, mula 1.0 hanggang 4.0mM, na may pagitan na 0.5–1mM sa pagitan.
Ito ay nagkakahalaga ng noting na ang maramihang mga freeze-thaw cycle ay maaaring humantong sa konsentrasyon stratification ng magnesium chloride solution .Samakatuwid, dapat mong ganap na matunaw ito bago ang bawat paggamit, at ihalo ito ng mabuti bago gamitin ito.
Bovine serum albumin(Bovine albumin, BSA)
Sa mga eksperimento sa molecular chemistry, ang bovine serum albumin ay isang pangkaraniwang additive, lalo na sa restriction enzyme digestion at PCR experiments.Sa mga reaksyon ng PCR, nakakatulong ang BSA sa pagbabawas ng mga kontaminant tulad ng mga phenolic compound.At ito rin daw ay nakakabawas sa pagdikit ng mga reactant sa dingding ng test tube.Sa reaksyon ng PCR, kadalasan ang konsentrasyon ng BSA na idinagdag ay maaaring umabot sa 0.8 mg/ml.
 
Kaugnay na Mga Produkto:
Bayani ng PCR(may pangkulay)
Bayani ng PCR