Ang direktang PCR ay isang reaksyon na direktang gumagamit ng mga tissue ng hayop o halaman para sa amplification nang walang pagkuha ng nucleic acid.Sa maraming paraan, gumagana ang direktang PCR tulad ng regular na PCR

Ang pangunahing pagkakaiba ay ang pasadyang buffer na ginamit sa direktang PCR, ang sample ay maaaring direktang sumailalim sa reaksyon ng PCR nang walang pagkuha ng nucleic acid, ngunit may mga kaukulang kinakailangan para sa pagpapaubaya ng mga enzyme at ang pagiging tugma ng buffer na kasangkot sa direktang reaksyon ng PCR.

Bagaman mayroong higit pa o mas kaunting mga PCR inhibitor sa mga karaniwang sample, ang direktang PCR ay maaari pa ring makamit ang maaasahang amplification sa ilalim ng pagkilos ng mga enzyme at buffer.Ang tradisyunal na reaksyon ng PCR ay nangangailangan ng mataas na kalidad na nucleic acid bilang isang template, na maaaring makapigil sa maayos na pag-unlad ng reaksyon ng PCR kung ang template ay naglalaman ng mga protina at iba pang mga dumi.Ang Direct PCR ay kasalukuyang isa sa mga pinakasikat na teknolohiya sa larangan ng molecular diagnostics.

01 Direct PCR ay orihinal na ginamit para sa hayop at halaman

Ang pinakamaagang paggamit ng direktang PCR ay sa larangan ng mga hayop at halaman, tulad ng dugo, tissue at buhok ng daga, pusa, manok, kuneho, tupa, baka, atbp., dahon at buto ng halaman, atbp., na ginagamit upang pag-aralan ang genotyping, transgenic, plasmid detection, Gene knockout analysis, DNA source identification, species identification, SNP analysis at iba pang field analysis.

Ang mga patlang na ito ay may ilang mga karaniwang tampok, iyon ay, ang target na nilalaman ng gene ay medyo mataas at ang pagkuha ng nucleic acid ay mahirap, kaya ang direktang PCR ay hindi lamang makakatipid ng oras at may maliit na epekto sa mga resulta, ngunit nakakatipid din ng gastos.

Ang direktang PCR na ginagamit para sa pagtuklas ng pathogen ay isang bagay ng mga nakaraang taon, ang ilang mga tagagawa ng PCR reagent ay gumawa ng maraming pagsisikap sa direksyong ito kapag gumagawa ng pagbabago.Lalo na sa epidemya ng COVID-19 na ito, maraming mga naturang detection na produkto ang lumabas sa merkado, gaya ng SARS-CoV-2 Nucleic Acid Detection Kit (Multiplex PCR Fluorescent Probe Method) na sinaliksik at binuo ng Foregene, na gumagamit ng Real-time RT PCR technology (rRT-PCR) para sa qualitative detection ng SARS-CoV-2 o nasropharyngeal na sample ng nucleic acid sa human nucleic acid.

Ang Foregene ay isa sa mga kumpanyang gumagamit ng Direct PCR na teknolohiya, para sa pagtuklas ng normal na ORF1ab, N, E, atvariant lineages nucleic acids sa human nasopharyngeal o oropharyngeal swab samples gaya ng SARS-CoV-2 B.1.1.7 lineage (UK), B.1.351 lineage (ZA), B.1.617 lineage (IND) at P.1 lineage (BR).

02  Reagents na kailangan para sa direktang PCR

Halimbawang Lysate

Ang sample lysate ay maaaring i-configure nang mag-isa o bilhin.Ang pagkakaiba sa komposisyon ng iba't ibang mga tatak ng lysate ay gagawing iba ang kakayahan ng lysing, at pagkatapos ay ang oras ng lysing ay bahagyang naiiba.Halimbawa, para sa paghahanda ng mga sample ng tissue ng hayop, karaniwang inirerekomenda ang 30 minuto o magdamag na lysis, at ang lysis solution para sa mga virus ay umaabot sa 3-10 minuto.

PCR master mix

Inirerekomenda na gumamit ng hot-start na DNA polymerase upang mapahusay ang partikular na amplification at mapataas ang kakayahan sa amplification.Ang core ng direktang PCR ay isang mataas na mapagparaya na polymerase.

Tanggalin o pigilan ang mga bahagi sa sample na nakakaapekto sa amplification ng DNA

Matapos maproseso ang sample na may lysate, ang mga protina, lipid at iba pang mga labi ng cell ay ilalabas, ang mga sangkap na ito ay magpipigil sa reaksyon ng PCR.Samakatuwid, ang direktang PCR ay nangangailangan ng pagdaragdag ng kaukulang pagtanggal o mga inhibitor upang mabawasan ang impluwensya ng mga salik na ito.

03  Isang koleksyon ng limang puntos ng kaalaman ng direktang PCR

Una, ang Direct PCR technology ay isang direktang PCR na teknolohiya para sa iba't ibang biological sample.Sa ilalim ng teknikal na kondisyong ito, hindi na kailangang paghiwalayin at kunin ang nucleic acid, direktang gamitin ang sample ng tissue bilang object, at idagdag ang target na mga primer ng gene upang maisagawa ang reaksyon ng PCR.

Pangalawa, ang Direct PCR na teknolohiya ay hindi lamang isang tradisyonal na teknolohiyang amplification ng template ng DNA, ngunit kasama rin ang RNA template reverse transcription PCR.

Pangatlo, ang Direct PCR na teknolohiya ay hindi lamang direktang gumaganap ng mga regular na qualitative na reaksyon ng PCR sa mga sample ng tissue, ngunit kasama rin ang Real-Time na qPCR na mga reaksyon, na nangangailangan ng sistema ng reaksyon na magkaroon ng malakas na anti-background fluorescence interference na kakayahan at endogenous fluorescence quenchers ang antagonistic na kakayahan.

Pang-apat, ang mga sample na na-target ng Direct PCR na teknolohiya ay nangangailangan lamang ng paglabas ng mga template ng nucleic acid, at huwag mag-alis ng mga protina, polysaccharides, salt ions, atbp. na nakakasagabal sa reaksyon ng PCR.Na nangangailangan ng nucleic acid polymerase at PCR Mix sa sistema ng reaksyon upang magkaroon ng mahusay na pagtutol at kakayahang umangkop upang matiyak ang aktibidad ng enzyme at katumpakan ng pagtitiklop sa ilalim ng mga kumplikadong kondisyon.

Ikalima, ang sample ng tissue na na-target ng Direct PCR na teknolohiya nang walang anumang paggamot sa pagpapayaman ng nucleic acid at ang halaga ng template ay napakaliit, na nangangailangan ng sistema ng reaksyon na magkaroon ng napakataas na sensitivity at kahusayan ng amplification.