Ang natatanging tampok ng reaksyon ng PCR ay ang malaking kapasidad ng amplification at napakataas na sensitivity.Upang mapahusay ang pagganap ng PCR at kahusayan sa pag-detect, nakatuon kami sa pagpapabuti ng kapasidad ng amplification ng PCR at pagiging sensitibo sa pagtuklas, ngunit ang sakit ng ulo ay nasa proseso ng eksperimento.Madalas na nangyayari ang mga maling positibo, at ang napakaliit na halaga ng sample na cross-contamination o kontaminasyon ng produkto ng PCR ay maaaring magdulot ng mga maling positibo sa eksperimento.
Limang uri ng kontaminasyon ng produkto ng PCR
Mayroong maraming mga dahilan para sa kontaminasyon ng PCR, na maaaring halos nahahati sa mga sumusunod na kategorya:
Ang kontaminasyon ng ispesimen ay pangunahing sanhi ng kontaminasyon ng lalagyan para sa pagkolekta ng ispesimen, o kapag ang ispesimen ay inilagay, ito ay tumagas sa labas ng lalagyan dahil sa maluwag na sealing, o ang ispesimen ay nakadikit sa labas ng lalagyan, na nagiging sanhi ng cross-contamination;Ang kontaminasyon ay humahantong sa kontaminasyon sa pagitan ng mga ispesimen;ilang microbial specimens, lalo na ang mga virus, ay maaaring kumalat kasama ng mga aerosols o bumubuo ng mga aerosol, na nagreresulta sa kapwa kontaminasyon.
Ang pangunahing dahilan ay na sa panahon ng paghahanda ng PCR reagents, ang sample na baril, lalagyan, double distilled water at iba pang mga solusyon ay kontaminado ng PCR nucleic acid template.
Sa molecular biology laboratories at ilang laboratoryo na gumagamit ng mga cloned plasmid bilang positibong kontrol, karaniwan din ang problema ng cloned plasmid contamination.Dahil ang nilalaman ng pag-clone ng plasmid sa dami ng yunit ay medyo mataas, at higit pang mga tool at reagents ang kailangan sa proseso ng paglilinis, at ang plasmid sa mga buhay na selula ay malamang na makontaminado dahil sa malakas na paglaki at kakayahan sa pagpaparami ng mga buhay na selula.
Ang kontaminasyon ng mga amplified na produkto ay ang pinakakaraniwang problema sa kontaminasyon sa mga reaksyon ng PCR.Dahil malaki ang kopya ng produkto ng PCR (karaniwan ay 1013 kopya/ml), na mas mataas kaysa sa limitasyon ng numero ng kopya ng PCR detection, ang napakaliit na halaga ng kontaminasyon sa produkto ng PCR ay maaaring magdulot ng mga maling positibo.
Ang polusyon sa aerosol ay ang pinaka-malamang na anyo ng kontaminasyon ng mga produkto ng PCR, at ito rin ang pinakamadaling hindi mapapansin.Ito ay nabuo sa pamamagitan ng alitan sa pagitan ng likidong ibabaw at ng hangin.Sa pangkalahatan, ang kontaminasyon ng aerosol ay maaaring mabuo kapag ang takip ay binuksan, kapag ang sample ay aspirated, o kahit na ang reaksyon tube ay inalog nang malakas.Ayon sa mga kalkulasyon, ang isang aerosol particle ay maaaring maglaman ng 48,000 kopya, kaya't ang polusyon na dulot nito ay isang problema na nararapat ng espesyal na pansin.
Sa partikular, ang mga laboratoryo sa pagsubok ay kadalasang gumagamit ng parehong pares ng mga panimulang aklat upang subukan ang isang partikular na gene.Sa paglipas ng panahon, isang malaking halaga ng kontaminasyon ng produkto ng PCR ang magaganap sa espasyo ng laboratoryo.Kapag nangyari ang naturang kontaminasyon, mahirap itong alisin sa maikling panahon.
Para sa unang tatlong uri ng polusyon, maaari tayong gumamit ng mga epektibong paraan upang maiwasan, ngunit ang polusyon na dulot ng mga produktong PCR ay mahirap pigilan, lalo na sa pagtatayo ng mga hindi pamantayang laboratoryo ng PCR.Sa proseso ng PCR, kapag sinisipsip at hinipan ng pipette tip ang likido, at binuksan ang takip ng PCR tube, isang aerosol ang mabubuo.Ang mga molekula ng DNA na dala ng aerosol (ang isang aerosol ay maaaring magdala ng sampu-sampung libong DNA) ay mahirap alisin dahil lumulutang sila sa hangin.Kapag ang susunod na round ng mga eksperimento sa PCR ay ipinakilala, ang mga maling positibo ay hindi maiiwasang mangyari.
Gaya ng ipinapakita sa figure sa ibaba, pinalaki din ng negatibong kontrol ang katumbas na banda ng interes:
Ang unang bahagi ng isyung ito ng PCR pollution at prevention ay ipinakilala dito.Ang susunod na isyu ay maghahatid sa iyo ng ikalawang bahagi na "Pag-iwas sa kontaminasyon ng produkto ng PCR", kaya't manatiling nakatutok!
Oras ng post: Hul-25-2017
