Ang teknolohiya ng molekular na diagnosis ay gumagamit ng mga pamamaraan ng molecular biology upang makita ang pagpapahayag at istraktura ng genetic na materyal ng katawan ng tao at iba't ibang mga pathogen, upang makamit ang layunin ng paghula at pag-diagnose ng mga sakit.

Sa mga nagdaang taon, sa pag-upgrade at pag-ulit ng teknolohiyang diagnostic ng molekular, ang klinikal na aplikasyon ng mga diagnostic ng molekular ay naging mas malawak at malalim, at ang merkado ng molekular na diagnostic ay pumasok sa isang panahon ng mabilis na pag-unlad.

Binubuod ng may-akda ang mga karaniwang teknolohiyang diagnostic ng molekular sa merkado, at nahahati sa tatlong bahagi: ang unang bahagi ay nagpapakilala sa teknolohiya ng PCR, ang pangalawang bahagi ay nagpapakilala sa teknolohiya ng nucleic acid isothermal amplification, at ang pangalawang bahagi ay nagpapakilala sa teknolohiya ng sequencing.

01

Bahagi I: Teknolohiya ng PCR

Teknolohiya ng PCR

Ang PCR (polymerase chain reaction) ay isa sa mga in vitro DNA amplification na teknolohiya, na may kasaysayan ng higit sa 30 taon.

Ang teknolohiya ng PCR ay pinasimunuan noong 1983 ni Kary Mullis ng Cetus, USA.Nag-apply si Mullis para sa isang PCR patent noong 1985 at inilathala ang unang PCR academic paper sa Science sa parehong taon.Nanalo si Mullis ng Nobel Prize sa Chemistry noong 1993.

Mga Pangunahing Prinsipyo ng PCR

Maaaring palakihin ng PCR ang mga target na fragment ng DNA ng higit sa isang milyong beses.Ang prinsipyo ay na sa ilalim ng catalysis ng DNA polymerase, ang parent strand DNA ay ginagamit bilang isang template, at isang partikular na panimulang aklat ang ginagamit bilang panimulang punto para sa extension.Ito ay ginagaya sa vitro sa pamamagitan ng mga hakbang tulad ng denaturation, annealing, at extension.Ang proseso ng daughter strand DNA na pantulong sa parent strand template DNA.

Ang karaniwang proseso ng PCR ay nahahati sa tatlong hakbang:

1. Denaturasyon: Gumamit ng mataas na temperatura para paghiwalayin ang mga double strand ng DNA.Ang mga hydrogen bond sa pagitan ng mga double strand ng DNA ay nasisira sa mataas na temperatura (93-98°C).

2. Pagsusupil: Pagkatapos na paghiwalayin ang double-stranded na DNA, ang temperatura ay ibinababa upang ang panimulang aklat ay maaaring magbigkis sa single-stranded na DNA.

3. Extension: Ang DNA polymerase ay nagsisimulang mag-synthesize ng mga complementary strand sa kahabaan ng DNA strands mula sa mga primer na nakatali kapag ang temperatura ay binabaan.Kapag nakumpleto ang extension, isang cycle ang nakumpleto, at ang bilang ng mga fragment ng DNA ay doble.

Ang pag-rereciprocat ng tatlong hakbang na ito ng 25-35 beses, ang bilang ng mga fragment ng DNA ay tataas nang husto.

Ang katalinuhan ng PCR ay ang iba't ibang mga panimulang aklat ay maaaring idisenyo para sa iba't ibang mga target na gene, upang ang mga fragment ng target na gene ay maaaring palakihin sa maikling panahon.

Sa ngayon, ang PCR ay maaaring nahahati sa tatlong kategorya, katulad ng ordinaryong PCR, fluorescent quantitative PCR at digital PCR.

Ang unang henerasyon ng ordinaryong PCR

Gumamit ng isang ordinaryong PCR amplification instrument upang palakihin ang target na gene, at pagkatapos ay gumamit ng agarose gel electrophoresis upang makita ang produkto, tanging pagsusuri ng husay ang maaaring gawin.

Ang mga pangunahing kawalan ng unang henerasyon ng PCR:

-Prone sa hindi partikular na amplification at maling positibong resulta.

-Ang pagtuklas ay tumatagal ng mahabang panahon at ang operasyon ay mahirap.

-Ang qualitative testing lamang ang maaaring gawin.

Second-generation fluorescence quantitative PCR

Ang Fluorescence quantitative PCR (Real-Time PCR), na kilala rin bilang qPCR, ay ginagamit upang subaybayan ang akumulasyon ng mga amplified na produkto sa pamamagitan ng akumulasyon ng mga fluorescent signal sa pamamagitan ng pagdaragdag ng fluorescent probes na maaaring magpahiwatig ng pag-unlad ng reaction system, at upang hatulan ang mga resulta sa pamamagitan ng fluorescence curve, at Maaari itong ma-quantified sa tulong ng Cq value at standard curve.

Dahil ang teknolohiya ng qPCR ay isinasagawa sa isang saradong sistema, ang posibilidad ng kontaminasyon ay nabawasan, at ang fluorescence signal ay maaaring subaybayan para sa quantitative detection, kaya ito ang pinaka-tinatanggap na ginagamit sa klinikal na kasanayan at naging nangingibabaw na teknolohiya sa PCR.

Ang mga fluorescent substance na ginagamit sa real-time na fluorescent quantitative PCR ay maaaring nahahati sa: TaqMan fluorescent probes, molecular beacon at fluorescent dyes.

1) TaqMan fluorescent probe:

Sa panahon ng PCR amplification, isang partikular na fluorescent probe ang idinaragdag habang nagdaragdag ng isang pares ng mga primer.Ang probe ay isang oligonucleotide, at ang dalawang dulo ay ayon sa pagkakabanggit ay may label na isang reporter fluorescent group at isang quencher fluorescent group.

Kapag ang probe ay buo, ang fluorescent signal na ibinubuga ng reporter group ay nasisipsip ng quenching group;sa panahon ng PCR amplification, ang 5′-3′ exonuclease na aktibidad ng Taq enzyme ay pumuputol at nagpapababa sa probe, na ginagawa ang reporter na fluorescent group at quencher Ang fluorescent group ay pinaghihiwalay, upang ang fluorescence monitoring system ay makakatanggap ng fluorescence signal, iyon ay, sa tuwing ang DNA strand ay ganap na pinalaki, ang isang fluorescent na fluorescent na grupo ay nabubuo, at ang molekula ng fluorescent ay nabubuo ng fluorescent. ang produkto ng PCR.

2) SYBR fluorescent dyes:

Sa sistema ng reaksyon ng PCR, idinagdag ang labis na SYBR fluorescent dye.Matapos ang SYBR fluorescent dye ay hindi partikular na isinama sa DNA double-strand, naglalabas ito ng fluorescent signal.Ang SYBR dye molecule na hindi kasama sa chain ay hindi maglalabas ng anumang fluorescent signal, at sa gayon ay masisiguro ang fluorescent signal Ang pagtaas sa mga produkto ng PCR ay ganap na naka-synchronize sa pagtaas ng mga produkto ng PCR.Ang SYBR ay nagbubuklod lamang sa double-stranded na DNA, kaya ang melting curve ay magagamit upang matukoy kung ang reaksyon ng PCR ay tiyak.

3) Molecular beacon

Ito ay isang stem-loop na may double-label na oligonucleotide probe na bumubuo ng istraktura ng hairpin na may humigit-kumulang 8 base sa 5 at 3 dulo.Ang mga pagkakasunud-sunod ng nucleic acid sa magkabilang dulo ay magkatugmang ipinares, na nagiging sanhi ng pagiging mahigpit ng fluorescent group at ang quenching group.Isara, hindi ito gagawa ng fluorescence.

Matapos mabuo ang produkto ng PCR, sa panahon ng proseso ng pagsusubo, ang gitnang bahagi ng molecular beacon ay ipinares sa isang tiyak na pagkakasunud-sunod ng DNA, at ang fluorescent gene ay pinaghihiwalay mula sa quencher gene upang makagawa ng fluorescence.

Ang mga pangunahing kawalan ng pangalawang henerasyong PCR:

Kulang pa rin ang pagiging sensitibo, at hindi tumpak ang pagtuklas ng mga specimen na mababa ang kopya.

May impluwensya sa background na halaga, at ang resulta ay madaling makagambala.

Ikatlong henerasyong digital PCR

Kinakalkula ng Digital PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) ang numero ng kopya ng target na sequence sa pamamagitan ng end-point detection, at makakapagsagawa ng tumpak na absolute quantitative detection nang hindi gumagamit ng mga internal na kontrol at karaniwang curve.

Ang digital PCR ay gumagamit ng endpoint detection at hindi nakadepende sa Ct value (cycle threshold), kaya ang digital PCR reaction ay hindi gaanong apektado ng amplification efficiency, at ang tolerance sa PCR reaction inhibitors ay napabuti, na may mataas na katumpakan at reproducibility.

Dahil sa mga katangian ng mataas na sensitivity at mataas na katumpakan, hindi ito madaling makagambala ng mga inhibitor ng reaksyon ng PCR, at maaari itong makamit ang tunay na ganap na dami nang walang karaniwang mga produkto, na naging isang research at application hotspot.

Ayon sa iba't ibang anyo ng unit ng reaksyon, maaari itong nahahati sa tatlong uri: microfluidic, chip at droplet system.