Ang pagkawala ng pandinig (HL) ay ang pinakakaraniwang sakit na kapansanan sa pandama sa mga tao.Sa mga mauunlad na bansa, humigit-kumulang 80% ng mga kaso ng prelingual deafness sa mga bata ay sanhi ng genetic factor.Ang pinakakaraniwan ay mga single-gene defect (tulad ng ipinapakita sa Fig. 1), 124 gene mutations ang natagpuang nauugnay sa nonsyndromic hearing loss sa mga tao, ang iba ay sanhi ng environmental factors.Ang cochlear implant (isang electronic device na nakalagay sa inner ear na nagbibigay ng electrical stimulation nang direkta sa auditory nerve) ay sa ngayon ang pinaka-epektibong opsyon para sa paggamot sa malubhang HL, habang ang isang hearing aid (isang panlabas na electronic device na nagko-convert at nagpapalakas ng sound wave) ay makakatulong sa mga Pasyente na may katamtamang HL.Gayunpaman, sa kasalukuyan ay walang mga gamot na magagamit upang gamutin ang namamana na HL (GHL).Sa mga nagdaang taon, ang gene therapy ay tumanggap ng pagtaas ng atensyon bilang isang promising na diskarte sa paggamot sa panloob na dysfunction ng tainga.

Fig1.Pamamahagi ng uri ng pagkakaiba-iba na nauugnay sa pagkabingi.[1]

Kamakailan, inilathala ng mga siyentipiko mula sa Salk Institute at University of Sheffield ang isang resulta ng pananaliksik sa Molecular Therapy - Methods & Clinical Development [2], na nagpakita ng malawak na mga prospect ng aplikasyon para sa in vivo gene therapy ng namamana na pagkabingi.Uri Manor, assistant research professor sa Salk Institute at direktor ng Waitt Center for Advanced Biophotonics, ay nagsabi na siya ay ipinanganak na may malubhang pagkawala ng pandinig at nadama na ang pagpapanumbalik ng pandinig ay isang magandang regalo.Nalaman ng kanyang nakaraang pananaliksik na ang Eps8 ay isang actin regulatory protein na may actin binding at capping activities;sa mga selula ng buhok ng cochlear, ang kumplikadong protina na nabuo ng Eps8 na may MYO15A, WHIRLIN, GPSM2 at GNAI3 ay higit sa lahat ay umiiral sa karamihan.Samakatuwid, maaaring i-regulate ng Eps8 ang haba ng stereocilia ng mga selula ng buhok, na mahalaga para sa normal na paggana ng pandinig;Ang pagtanggal o mutation ng Eps8 ay hahantong sa maikling stereocilia, na ginagawang hindi nito maayos na mai-convert ang tunog sa mga electrical signal para sa perception ng utak, na humahantong naman sa pagkabingi..Kasabay nito, ang collaborator na si Walter Marcotti, isang propesor sa University of Sheffield, ay natagpuan na ang mga selula ng buhok ay hindi maaaring bumuo ng normal sa kawalan ng Eps8.Sa pag-aaral na ito, nakipagtulungan sina Manor at Marcotti upang siyasatin kung ang pagdaragdag ng Eps8 sa mga stereociliary cell ay maaaring maibalik ang kanilang function at, sa turn, mapabuti ang pandinig sa mga daga.Ginamit ng research team ang adeno-associated virus (AAV) vector na Anc80L65 para ihatid ang coding sequence na naglalaman ng wild-type na EPS8 sa cochlea ng Eps8-/- newborn P1-P2 mice sa pamamagitan ng round window membrane injection;sa mga selula ng buhok ng cochlear ng mouse Ang function ng stereocilia ay naayos bago sila tumanda;at ang epekto ng pag-aayos ay nailalarawan sa pamamagitan ng teknolohiya ng imaging at pagsukat ng stereocilia.Ipinakita ng mga resulta na pinalaki ng Eps8 ang haba ng stereocilia at naibalik ang function ng cell ng buhok sa mga low-frequency na cell.Nalaman din nila na, sa paglipas ng panahon, ang mga selula ay tila nawalan ng kakayahang iligtas ng gene therapy na ito.Ang implikasyon ay ang paggamot na ito ay maaaring kailangang ibigay sa utero, dahil ang Eps8-/- na mga selula ng buhok ay maaaring matured o naipon ang pinsalang hindi na naayos pagkatapos maipanganak ang mga daga."Ang Eps8 ay isang protina na may maraming iba't ibang mga function, at marami pa ring dapat tuklasin," sabi ni Manor.Kasama sa pananaliksik sa hinaharap ang pagsisiyasat sa epekto ng Eps8 gene therapy sa pagpapanumbalik ng pandinig sa iba't ibang yugto ng pag-unlad, at kung posible bang pahabain ang mga pagkakataon sa paggamot.Nagkataon, noong Nobyembre 2020, inilathala ni Propesor KarenB Avraham ng Tel Aviv University sa Israel ang kanyang mga resulta sa journal na EMBO Molecular Medicine [3], gamit ang isang makabagong teknolohiya ng gene therapy upang lumikha ng hindi nakakapinsalang synthetic adeno-associated virus na AAV9-PHP.B, Ang depekto ng gene sa mga selula ng buhok ng Syne4-/- mice ay naayos sa pamamagitan ng pag-iniksyon ng virus na nagdadala ng coding sequence ng Syne4 sa panloob na tainga ng mga daga, na nagpapahintulot dito na makapasok sa mga selula ng buhok at ilabas ang dala na genetic na materyal, na nagpapahintulot sa kanila na maging mature at gumana nang normal (tulad ng sa Fig. 2).

Fig2.Eskematiko na representasyon ng anatomya ng panloob na tainga, na may pagtuon sa theorgan ng Corti at ang cellular function ng nesprin-4.

Makikita na ang paggamit ng gene therapy upang makamit ang layunin ng paggamot sa mga namamana na sakit sa antas ng gene sa pamamagitan ng pagpasok, pag-alis o pagwawasto ng anumang mutated genes para sa paggamot (iyon ay, pagkontrol sa genetic na pagbabago sa sakit) ay may mataas na klinikal na epekto.mga prospect ng aplikasyon.Ang kasalukuyang mga pamamaraan ng gene therapy para sa genetically deficient na pagkabingi ay maaaring nahahati sa mga sumusunod na kategorya:

pagpapalit ng gene

Ang pagpapalit ng gene ay masasabing ang pinaka "tuwirang" paraan ng gene therapy, batay sa pagtukoy at pagpapalit ng isang may sira na gene ng isang normal o wild-type na kopya ng gene.Unang matagumpay na pag-aaral ng inner ear gene therapy para sa pagkawala ng pandinig na sanhi ng pagtanggal ng vesicular glutamate transporter 3 (VGLUT3) gene;AAV1-mediated delivery ng exogenous VGLUT3 overexpression sa inner ear hair cells (IHCs) Maaaring magresulta sa matagal na pagbawi ng pandinig, partial ribbon synaptic morphology recovery, at convulsive na mga tugon [4].Gayunpaman, sa mga halimbawa kabilang ang dalawang pagpapalit ng gene na inihatid ng AAV na inilarawan sa panimula sa itaas, mahalagang tandaan na ang mga modelo ng mouse na ginagamit para sa ilang uri ng gene deletion hereditary hearing disorder ay pansamantalang naiiba sa mga tao, at sa P1 mice , ang panloob na tainga ay nasa mature na yugto ng pag-unlad.Sa kaibahan, ang mga tao ay ipinanganak na may mature na panloob na tainga.Pinipigilan ng pagkakaibang ito ang posibleng paggamit ng mga resulta ng mouse sa paggamot ng namamana na mga sakit sa pagkabingi ng tao maliban kung ang gene therapy ay inihatid sa mga mature na tainga ng mouse.

Pag-edit ng Gene: CRISPR/Cas9

Kung ikukumpara sa "pagpapalit ng gene", ang pag-unlad ng teknolohiya sa pag-edit ng gene ay nagdala ng bukang-liwayway ng paggamot sa mga genetic na sakit mula sa ugat.Mahalaga, ang paraan ng pag-edit ng gene ay bumubuo sa mga pagkukulang ng tradisyonal na overexpression na mga pamamaraan ng gene therapy na hindi angkop para sa nangingibabaw na namamana na mga sakit sa pagkabingi, at ang problema na ang overexpression na paraan ay hindi nagtatagal.Pagkatapos partikular na i-knock out ng mga Chinese researcher ang Myo6C442Y mutant allele sa Myo6WT/C442Y mice gamit ang AAV-SaCas9-KKH-Myo6-g2 gene editing system, at sa loob ng 5 buwan ng knockout, mice Ang auditory function ng modelo ay naibalik;kasabay nito, napansin din na ang survival rate ng mga selula ng buhok sa panloob na tainga ay napabuti, ang hugis ng cilia ay naging regular, at ang mga electrophysiological indicator ay naitama [5].Ito ang unang pag-aaral sa mundo na gumamit ng teknolohiyang CRISPR/Cas9 para sa paggamot ng namamana na pagkabingi na dulot ng Myo6 gene mutation, at ito ay isang mahalagang pag-unlad ng pananaliksik ng teknolohiya sa pag-edit ng gene para sa paggamot ng namamana na pagkabingi.Ang klinikal na pagsasalin ng paggamot ay nagbibigay ng matibay na siyentipikong batayan.

Mga paraan ng paghahatid ng gene therapy

Upang maging matagumpay ang therapy ng gene, ang mga hubad na molekula ng DNA ay hindi maaaring tumagos nang epektibo sa mga cell dahil sa kanilang hydrophilicity at negatibong singil ng mga grupo ng pospeyt, at upang matiyak ang integridad ng mga suplementong molekula ng nucleic acid, dapat pumili ng isang ligtas at epektibong paraan.Ang dinagdag na DNA ay inihahatid sa target na cell o tissue.Ang AAV ay malawakang ginagamit bilang isang sasakyan sa paghahatid para sa paggamot sa sakit dahil sa mataas na nakakahawang epekto nito, mababang immunogenicity, at malawak na tropismo sa iba't ibang uri ng tissue.Sa kasalukuyan, natukoy ng isang malaking pangkat ng gawaing pananaliksik ang tropismo ng iba't ibang mga subtype ng AAV na nauugnay sa iba't ibang uri ng cell sa mouse cochlea.Ang paggamit ng mga katangian ng paghahatid ng AAV na sinamahan ng mga promotor na partikular sa cell ay maaaring makamit ang expression na partikular sa cell, na maaaring mabawasan ang mga epekto na hindi target.Bilang karagdagan, bilang alternatibo sa mga tradisyonal na AAV vector, ang mga bagong synthetic na AAV vector ay patuloy na ginagawa at nagpapakita ng higit na kakayahan sa transduction sa panloob na tainga, kung saan ang AAV2/Anc80L65 ang pinakamalawak na ginagamit.Ang mga paraan ng paghahatid na hindi viral ay maaaring higit pang nahahati sa mga pisikal na pamamaraan (microinjection at electroporation) at mga kemikal na pamamaraan (batay sa lipid, batay sa polimer, at nanoparticle ng ginto).Ang parehong mga diskarte ay ginamit sa paggamot ng namamana na mga karamdaman sa pagkabingi at nagpakita ng iba't ibang mga pakinabang at limitasyon.Bilang karagdagan sa paghahatid ng sasakyan para sa gene therapy bilang isang sasakyan, ang iba't ibang mga diskarte para sa in vivo gene administration ay maaaring gamitin batay sa iba't ibang uri ng target na cell, ruta ng pangangasiwa, at therapeutic efficacy.Ang masalimuot na istraktura ng panloob na tainga ay nagpapahirap na maabot ang mga target na selula at ang pamamahagi ng mga ahente sa pag-edit ng genome ay mabagal.Ang membranous labyrinth ay matatagpuan sa loob ng bony labyrinth ng temporal bone at kasama ang cochlear duct, semicircular duct, utricle, at balloon.Nililimitahan ng relatibong paghihiwalay nito, minimal na sirkulasyon ng lymphatic, at paghihiwalay mula sa dugo ng isang blood-maze barrier ang epektibong sistematikong paghahatid ng mga therapeutics sa mga neonatal na daga lamang.Upang makakuha ng viral titers na angkop para sa gene therapy, ang direktang lokal na pag-iniksyon ng mga viral vector sa panloob na tainga ay kinakailangan.Ang mga itinatag na ruta ng iniksyon ay kinabibilangan ng [6]: (1) round window membrane (RWM), (2) tracheostomy, (3) endolymphatic o perilymphatic cochleostomy, (4) round window membrane plus Tube fenestration (CF) (tulad ng sa Fig. 3).

Fig3.Inner ear delivery ng gene therapy.

Bagama't maraming pag-unlad ang nagawa sa gene therapy, batay sa mga klinikal na layunin sa pagsasalin, mas maraming trabaho ang kailangang gawin bago ang gene therapy ay maaaring maging isang opsyon sa paggamot sa unang linya para sa mga pasyenteng may genetic na sakit, lalo na sa pagbuo ng mga ligtas at epektibong vectors at paraan ng paghahatid.Ngunit naniniwala kami na sa nalalapit na hinaharap, ang mga uri ng paggamot na ito ay magiging isang staple ng personalized na therapy at magkakaroon ng malaking positibong epekto sa buhay ng mga taong may genetic disorder at kanilang mga pamilya.

Ang Foregene ay naglunsad din ng high-throughput screening kit para sa mga naka-target na gene, na mabilis at maaaring magsagawa ng reverse transcription at qPCR reactions nang walang RNA extraction.

Mga Link ng Produkto

Cell Direct RT-qPCR kit—Taqman/SYBR GREEN I

Para sa karagdagang impormasyon ng produkto, mangyaring makipag-ugnayan sa:

overseas@foregene.com