Ang halaga ng Ct ay ang pinakamahalagang anyo ng pagtatanghal ng resulta ng fluorescent quantitative PCR.Ito ay ginagamit upang kalkulahin ang mga pagkakaiba sa expression ng gene o numero ng kopya ng gene.Kaya ano ang halaga ng Ct ng fluorescence quantification na itinuturing na makatwiran?Paano masisiguro ang epektibong hanay ng halaga ng Ct?
Ano ang Ct Value?
Sa panahon ng proseso ng amplification ng qPCR, ang kaukulang bilang ng mga cycle ng amplification (Cycle Threshold) kapag ang fluorescence signal ng amplified na produkto ay umabot sa itinakdang fluorescence threshold.Ang C ay nangangahulugang Cycle at ang T ay nangangahulugang Threshold.Sa madaling salita, ang Ct value ay ang bilang ng mga cycle na tumutugma sa kung kailan umabot ang paunang template amplification sa isang tiyak na halaga ng produkto sa qPCR.Ang tinatawag na "isang tiyak na halaga ng produkto" ay ipapaliwanag sa ibang pagkakataon.
Ano ang ginagawa ng Ct value?
1. Relasyon sa pagitan ng exponential amplification, halaga ng template at halaga ng Ct
Sa isip, ang mga gene sa qPCR ay naipon sa pamamagitan ng exponential amplification pagkatapos ng isang tiyak na bilang ng mga cycle.Ang kaugnayan sa pagitan ng bilang ng mga ikot ng amplification at ang dami ng mga produkto ay: Pinalakas na halaga ng produkto = halaga ng paunang template × (1+En) na numero ng mga cycle.Gayunpaman, ang reaksyon ng qPCR ay hindi palaging nasa perpektong sitwasyon.Kapag ang halaga ng pinalakas na produkto ay umabot sa isang "tiyak na halaga ng produkto", ang bilang ng mga cycle sa oras na ito ay ang halaga ng Ct, at ito ay nasa exponential amplification period.Ang ugnayan sa pagitan ng halaga ng Ct at ng halaga ng panimulang template: Mayroong linear na ugnayan sa pagitan ng halaga ng Ct ng template at ang logarithm ng panimulang numero ng kopya ng template.Kung mas mataas ang paunang konsentrasyon ng template, mas maliit ang halaga ng Ct;mas mababa ang paunang konsentrasyon ng template, mas malaki ang halaga ng Ct.
2. Amplification curve, fluorescence threshold at ilang partikular na halaga ng produkto ng PCR
Ang halaga ng produkto ng qPCR amplification ay direktang ipinakita sa anyo ng fluorescent signal, iyon ay, ang amplification curve.Sa unang bahagi ng PCR, ang amplification ay nasa ilalim ng perpektong mga kondisyon, ang bilang ng mga cycle ay maliit, ang akumulasyon ng produkto ay maliit, at ang antas ng fluorescence ay hindi malinaw na nakikilala mula sa fluorescence background.Pagkatapos nito, tumataas ang fluorescence at pumapasok sa exponential phase.Ang dami ng produkto ng PCR ay maaaring matukoy sa isang tiyak na punto kapag ang reaksyon ng PCR ay nasa exponential phase lamang, na maaaring magamit bilang "isang tiyak na halaga ng produkto", at ang unang nilalaman ng template ay maaaring mahihinuha mula dito.Samakatuwid, ang fluorescence signal intensity na tumutugma sa isang tiyak na halaga ng produkto ay ang fluorescence threshold.
Sa huling yugto ng PCR, ang amplification curve ay hindi na nagpapakita ng exponential amplification, at pumapasok sa linear phase at plateau phase.
3.Reproducibility ng mga halaga ng Ct
Kapag naabot ng PCR cycle ang cycle number ng Ct value, kakapasok lang nito sa totoong exponential amplification period.Sa oras na ito, ang maliit na error ay hindi pa pinalaki, kaya ang reproducibility ng halaga ng Ct ay mahusay, iyon ay, ang parehong template ay pinalaki sa iba't ibang oras o sa iba't ibang mga tubo sa parehong oras.Pagpapalakas, ang nakuha na halaga ng Ct ay pare-pareho.
1.Pagpapalakas ng kahusayan En
Ang kahusayan ng PCR amplification ay tumutukoy sa kahusayan kung saan ang polymerase ay nagko-convert ng gene upang palakihin sa isang amplicon.Ang kahusayan ng amplification kapag ang isang molekula ng DNA ay nabago sa dalawang molekula ng DNA ay 100%.Ang kahusayan sa amplification ay karaniwang ipinahayag bilang En.Upang mapadali ang pagsusuri ng mga kasunod na artikulo, ang mga salik na nakakaapekto sa kahusayan ng amplification ay ipinakilala sa madaling sabi.
| Mga bagay na naka-impluwensiya | pagpapaliwanag | Paano mag judge? |
| A. PCR inhibitors | 1. Ang template na DNA ay naglalaman ng mga sangkap na pumipigil sa reaksyon ng PCR, tulad ng mga protina o detergent.2. Ang cDNA pagkatapos ng reverse transcription ay naglalaman ng mataas na konsentrasyon ng template na RNA o RT reagent na mga bahagi, na maaari ring humadlang sa kasunod na reaksyon ng PCR. | 1. Kung may polusyon ay maaaring hatulan sa pamamagitan ng pagsukat ng ratio ng A260/A280 at A260/A230 o RNA electrophoresis.2. Kung ang cDNA ay diluted ayon sa isang tiyak na ratio pagkatapos ng reverse transcription. |
| B. Hindi wastong disenyo ng panimulang aklat | Ang mga panimulang aklat ay hindi mahusay na nasusubok | Suriin ang mga panimulang aklat para sa mga primer-dimer o hairpins, hindi pagkakatugma, at kung minsan ay sumasaklaw sa mga intronic na disenyo. |
| C. Hindi wastong disenyo ng PCR reaction program | 1. Ang mga panimulang aklat ay hindi maaaring epektibong mag-anneal2. Hindi sapat na paglabas ng DNA polymerase 3. Nabawasan ang aktibidad ng DNA polymerase sa mahabang panahon na may mataas na temperatura | 1. Ang temperatura ng pagsusubo ay mas mataas kaysa sa halaga ng TM ng panimulang aklat2. Masyadong maikli ang pre-denaturation time 3. Masyadong mahaba ang oras ng bawat yugto ng proseso ng reaksyon |
| D. Hindi sapat na paghahalo ng mga reagents o mga error sa pipetting | Sa sistema ng reaksyon, ang lokal na konsentrasyon ng mga bahagi ng reaksyon ng PCR ay masyadong mataas o hindi pantay, na nagreresulta sa non-exponential amplification ng PCR amplification. | |
| E. Haba ng Amplicon | Masyadong mahaba ang haba ng amplicon, lampas sa 300bp, at mababa ang kahusayan ng amplification | Suriin na ang haba ng amplicon ay nasa pagitan ng 80-300bp |
| F. Impluwensiya ng qPCR reagents | Ang konsentrasyon ng DNA polymerase sa reagent ay mababa o ang konsentrasyon ng mga ion sa buffer ay hindi na-optimize, na nagreresulta sa aktibidad ng Taq enzyme na hindi umabot sa maximum | Pagpapasiya ng kahusayan ng amplification sa pamamagitan ng karaniwang curve |
2. Saklaw ng mga halaga ng Ct
Ang mga halaga ng Ct ay mula 15-35.Kung ang halaga ng Ct ay mas mababa sa 15, itinuturing na ang amplification ay nasa saklaw ng baseline period at hindi naabot ang fluorescence threshold.Sa isip, mayroong isang linear na relasyon sa pagitan ng halaga ng Ct at ang logarithm ng paunang numero ng kopya ng template, iyon ay, ang karaniwang curve.Sa pamamagitan ng karaniwang curve, kapag ang kahusayan sa amplification ay 100%, ang kinakalkula na halaga ng Ct para sa pag-quantify ng solong numero ng kopya ng gene ay nasa paligid ng 35. Kung ito ay higit sa 35, ang unang numero ng kopya ng template ay theoretically mas mababa sa 1, na maaaring ituring na walang kahulugan.
Para sa iba't ibang hanay ng gene Ct, dahil sa pagkakaiba sa numero ng kopya ng gene at kahusayan sa pagpapalakas sa paunang halaga ng template, kinakailangan na gumawa ng karaniwang curve para sa gene at kalkulahin ang linear detection range ng gene.
3. Nakakaimpluwensya sa mga kadahilanan ng halaga ng Ct
Mula sa ugnayan sa pagitan ng bilang ng mga cycle ng amplification at ng dami ng produkto: dami ng pinalakas na produkto = halaga ng inisyal na template × (1+En) cycle number, makikita na sa ilalim ng ideal na mga kondisyon, ang halaga ng paunang template at En ay magkakaroon ng negatibong epekto sa halaga ng Ct.Ang pagkakaiba sa kalidad ng template o kahusayan sa amplification ay magiging sanhi ng Ct value na maging masyadong malaki o masyadong maliit.
4.Ang halaga ng Ct ay masyadong malaki o masyadong maliit
Oras ng post: Peb-22-2023
