Ang PCR ay ang pinaka-tinatanggap na ginagamit na teknolohiya ng pagpapalakas ng nucleic acid at malawakang ginagamit dahil sa pagiging sensitibo at pagtitiyak nito.Gayunpaman, ang PCR ay nangangailangan ng paulit-ulit na thermal denaturation at hindi maaalis ang mga limitasyon ng pag-asa sa mga instrumento at kagamitan, na naglilimita sa paggamit nito sa clinical field testing.

Mula noong unang bahagi ng 1990s, maraming mga laboratoryo ang nagsimulang bumuo ng patuloy na teknolohiya ng pagpapalakas ng temperatura na hindi nangangailangan ng thermal denaturation.Ngayon ay nakabuo na sila ng loop-mediated isothermal amplification technology, strand replacement isothermal amplification technology, rolling circle isothermal amplification technology, at nucleic acid sequence dependence.Isothermal amplification technology at iba pang teknolohiya. 

Loop-mediated isothermal amplification

Ang prinsipyo ng amplification ay batay sa katotohanan na ang DNA ay nasa isang dynamic na equilibrium na estado sa humigit-kumulang 65°C.Kapag ang anumang panimulang aklat ay base-pares at pinalawak sa komplementaryong bahagi ng double-stranded na DNA, ang ibang strand ay maghihiwalay at magiging single-stranded.

Sa temperaturang ito, gumagamit ang DNA ng 4 na partikular na primer upang umasa sa isang strand-displacement DNA polymerase upang patuloy na magpa-circulate sa sarili ang synthesis ng strand-displacement DNA.

Tukuyin muna ang 6 na partikular na rehiyon F3, F2, F1, B1, B2, B3 sa target na gene, at pagkatapos ay magdisenyo ng 4 na panimulang aklat batay sa 6 na partikular na rehiyong ito (tulad ng ipinapakita sa figure sa ibaba):

Ang forward inner primer (FIP) ay binubuo ng F1c at F2.

Ang backward inner primer (BIP) ay binubuo ng B1c at B2, at ang TTTT ay ginagamit bilang spacer sa gitna.

Ang mga panlabas na primer na F3 at B3 ay ayon sa pagkakabanggit ay binubuo ng mga rehiyon ng F3 at B3 sa target na gene.

Sa sistema ng reaksyon ng LAMP, ang konsentrasyon ng panloob na primer ay ilang beses kaysa sa panlabas na primer.Ang panloob na panimulang aklat ay unang pinagsama sa template strand upang mag-synthesize ng isang komplementaryong strand upang bumuo ng DNA double strand.Kasunod nito, ang panlabas na primer ay pinagsama sa template strand upang makabuo ng DNA double strand.Sa ilalim ng pagkilos ng BstDNA polymerase, ang komplementaryong strand na na-synthesize ng panloob na primer ay inilabas.Pagkatapos ng isang serye ng mga reaksyon, ang komplementaryong strand sa wakas ay bumubuo ng isang solong DNA strand na may istraktura ng dumbbell.

Ang dumbbell structure na DNA single strand mismo ay ginagamit bilang template para patuloy na bumuo ng transitional stem-loop structure DNA na may bukas na dulo.Ang panloob at panlabas na mga panimulang aklat ay gumagabay sa transitional stem-loop structure na DNA upang patuloy na sumailalim sa strand displacement at extension reactions, at sa wakas ay bumuo ng maramihang stem-loop na istruktura na may iba't ibang haba.pinaghalong DNA.

Mga kalamangan at kawalan ng loop-mediated isothermal amplification

Mga Bentahe ng LAMP:

(1) Mataas na kahusayan sa amplification, na maaaring epektibong palakasin ang 1-10 kopya ng target na gene sa loob ng 1h, at ang kahusayan sa amplification ay 10-100 beses kaysa sa ordinaryong PCR.

(2) Ang oras ng reaksyon ay maikli, ang pagtitiyak ay malakas, at walang espesyal na kagamitan ang kinakailangan.

Mga pagkukulang ng LAMP:

(1) Ang mga kinakailangan para sa mga panimulang aklat ay partikular na mataas.

(2) Ang amplified na produkto ay hindi maaaring gamitin para sa cloning at sequencing, ngunit maaari lamang gamitin para sa paghatol.

(3) Dahil sa malakas na sensitivity nito, madaling bumuo ng mga aerosol, na nagdudulot ng mga maling positibo at nakakaapekto sa mga resulta ng pagsubok.

Spagpapalakas ng trans displacement

Ang Strand displacement amplification (SDA) ay isang in vitro isothermal DNA amplification technique batay sa enzymatic reaction na unang iminungkahi ng American scholar Walker noong 1992.

Kasama sa basic system ng SDA ang restriction endonuclease, DNA polymerase na may strand displacement activity, dalawang pares ng primers, dNTPs, at calcium at magnesium ions at buffer system.

Ang prinsipyo ng strand displacement amplification ay batay sa chemically modified restriction endonuclease recognition sequence sa magkabilang dulo ng target na DNA.Binubuksan ng endonuclease ang puwang sa strand DNA sa lugar ng pagkilala nito, at pinahaba ng DNA polymerase ang gap na 3′ End at pinapalitan ang susunod na DNA strand.

Ang pinalitan na mga solong hibla ng DNA ay maaaring pagsamahin sa mga panimulang aklat at palawigin sa dobleng hibla ng DNA polymerase.Ang prosesong ito ay paulit-ulit nang tuluy-tuloy, upang ang target na sequence ay mahusay na pinalaki.

Mga kalamangan at kawalan ng teknolohiya ng strand displacement amplification

Mga Bentahe ng SDA:

Ang kahusayan ng amplification ay mataas, ang oras ng reaksyon ay maikli, ang pagtitiyak ay malakas, at walang espesyal na kagamitan ang kinakailangan.

Mga pagkukulang ng SDA:

Ang mga produkto ay hindi pare-pareho, at ang ilang mga single-stranded at double-stranded na mga produkto ay palaging ginagawa sa SDA cycle, at ang tailing ay hindi maiiwasang mangyari kapag nakita ng electrophoresis.

Rolling circle amplification

Ang rolling circle amplification (RCA) ay iminungkahi sa pamamagitan ng pagguhit sa paraan ng pagkopya ng DNA mula sa mga pathogenic na organismo sa pamamagitan ng rolling circle.Ito ay tumutukoy sa paggamit ng single-stranded circular DNA bilang isang template sa isang pare-parehong temperatura, at isang espesyal na DNA polymerase (tulad ng Phi29) ) Sa ilalim ng pagkilos ng rolling circle DNA synthesis upang makamit ang amplification ng target na gene.

Maaaring nahahati ang RCA sa linear amplification at exponential amplification.Ang kahusayan ng linear RCA ay maaaring umabot sa 10⁵beses, at ang kahusayan ng exponential RCA ay maaaring umabot sa 10⁹beses.

Simpleng pagkakaiba, tulad ng ipinapakita sa figure sa ibaba, ang linear amplification a ay gumagamit lamang ng 1 primer, exponential amplification b ay may 2 primers.

Ang linear RCA ay tinatawag ding single primer RCA.Ang isang panimulang aklat ay nagbubuklod sa pabilog na DNA at pinalawak ng pagkilos ng DNA polymerase.Ang produkto ay isang linear na solong strand na may malaking bilang ng mga paulit-ulit na pagkakasunud-sunod na libu-libong beses ang haba ng isang loop.

Dahil ang produkto ng linear RCA ay palaging konektado sa panimulang primer, ang madaling pag-aayos ng signal ay isang pangunahing bentahe.

Ang Exponential RCA, na kilala rin bilang Hyper branched amplification HRCA (Hyper branched RCA), sa exponential RCA, ang isang primer ay nagpapalaki sa produkto ng RCA, ang pangalawang primer ay nagha-hybrid sa produkto ng RCA at lumalawak, at ang kapalit ay nakatali na sa produkto ng RCA Ang mga downstream na primer ay nagpapahaba sa strand, at inuulit ang pagpapalawak at pagpapalit upang makagawa ng isang dendritic na produkto na RCA.

Ang mga pakinabang at disadvantages ng rolling circle nucleic acid amplification

Mga Bentahe ng RCA:

Mataas na sensitivity, mahusay na pagtitiyak at madaling operasyon.

Mga pagkukulang ng RCA:

Mga problema sa background habang nagde-detect ng signal.Sa panahon ng reaksyon ng RCA, ang uncirculated padlock probe at ang template na DNA o RNA ng unbound probe ay maaaring makabuo ng ilang background signal. 

Nucleicacid sequence-based amplification

Ang nucleic acid sequence-based amplification (NASBA) ay isang bagong teknolohiya na binuo batay sa PCR.Ito ay isang tuluy-tuloy at isothermal na nucleic acid amplification na ginagabayan ng isang pares ng mga primer na may T7 promoter sequence.Maaaring palakihin ng teknolohiya ang template na RNA ng humigit-kumulang 109 beses sa loob ng halos 2 oras, na 1000 beses na mas mataas kaysa sa kumbensyonal na paraan ng PCR at hindi nangangailangan ng espesyal na kagamitan.

Ang teknolohiyang ito ay ginamit para sa mabilis na pagsusuri ng mga sakit sa sandaling lumitaw ito, at maraming kumpanya ang kasalukuyang gumagamit ng pamamaraang ito sa mga RNA detection kit.

Kahit na ang RNA amplification ay maaari ding gumamit ng reverse transcription PCR na teknolohiya, ang NASBA ay may sariling mga pakinabang: maaari itong isagawa sa ilalim ng medyo pare-pareho ang mga kondisyon ng temperatura, at ito ay mas matatag at tumpak kaysa sa tradisyonal na teknolohiya ng PCR.

Ang reaksyon ay nasa 41 degrees Celsius at nangangailangan ng AMV (avian myeloblastosis virus) reverse transcriptase, RNase H, T7 RNA polymerase at isang pares ng mga primer upang makumpleto.

Pangunahing kasama sa proseso ang:

Ang pasulong na panimulang aklat ay naglalaman ng pantulong na pagkakasunud-sunod ng tagataguyod ng T7.Sa panahon ng reaksyon, ang forward primer ay nagbubuklod sa RNA strand at na-catalyzed ng AMV enzyme upang bumuo ng DNA-RNA double strand.

Tinutunaw ng RNase H ang RNA sa hybrid double-strand at pinapanatili ang single-stranded DNA.

Sa ilalim ng pagkilos ng reverse primer at ng AMV enzyme, isang DNA double strand na naglalaman ng T7 promoter sequence ay nabuo.

Sa ilalim ng pagkilos ng T7 RNA polymerase, ang proseso ng transkripsyon ay nakumpleto at ang isang malaking halaga ng target na RNA ay ginawa.

Mga kalamangan ng NASBA:

(1) Ang primer nito ay may T7 promoter sequence, ngunit ang foreign double-stranded DNA ay walang T7 promoter sequence at hindi maaaring palakihin, kaya ang teknolohiyang ito ay may mataas na specificity at sensitivity.

(2) Direktang isinasama ng NASBA ang reverse transcription process sa amplification reaction, na nagpapaikli sa oras ng reaksyon.

Mga disadvantages ng NASBA:

(1) Ang mga bahagi ng reaksyon ay mas kumplikado.

(2) Tatlong uri ng mga enzyme ang kinakailangan upang gawing mas mataas ang gastos ng reaksyon.