Ang RT-qPCR ay ang pangunahing eksperimento ng molecular biology, at lahat ay dapat na pamilyar dito.Pangunahing kasama nito ang tatlong hakbang: RNA extraction, reverse transcription sa cDNA, at real-time fluorescent quantitative PCR.Hindi ito nakakatulong, ano ang nangyayari?Malamang na may problema saang reverse transcription experiment!Bagama't tila ang reverse transcription experiment ay kailangan lamang magdagdag ng RNA, dNTP, primers, atreverse transcriptasesa centrifuge tube at haluing mabuti, ngunit sa aktwal na proseso ng operasyon, marami pa ring mga detalye na kailangang bigyang pansin.Alamin natin ang tungkol dito!

Paano hatulan ang kalidad ng RNA?
Upang makakuha ng cDNA, ang kalidad ng RNA ay kritikal!Ang kalidad ng RNA ay maaaring makita pangunahin mula sa dalawang aspeto:
(1) Integridad ng RNA:Ang integridad ng RNA ay maaaring ma-verify sa pamamagitan ng agarose gel electrophoresis. Ang pagkuha ng mga eukaryote bilang isang halimbawa, ang kumpletong kabuuang RNA ay may tatlong malinaw na mga banda, ang mga molekular na timbang mula sa malaki hanggang sa maliit ay 28S, 18S, at 5S, at ang 28S ay dalawang beses na mas maliwanag kaysa sa 18S;kung tatlong banda ang makikita, ngunit ang uri ng banda ay malabo o ang Diffusion ay nangangahulugan na ang RNA ay bahagyang nasira.Sa oras na ito, mangyaring isagawa kaagad ang reverse transcription reaction at dagdagan ang template input nang naaangkop;kung isang banda lamang na may maliit na molekular na timbang o walang banda ang makikita, ang RNA ay ganap na nasira at kailangang muling i-extract .Ang Agilent 2100 ay nagpapahiwatig ng integridad ng RNA na may peak diagram at halaga ng RIN.Kung ang nucleic acid ay buo, ang baseline ng electropherogram ay flat;kung ang nucleic acid ay malubhang nasira, ang baseline ay hindi pantay at mas maraming mga degradation peak ang lilitaw;ang halaga ng RIN ay sumasalamin sa integridad ng RNA, sa loob ng hanay ng 0-10, mas malaki ang halaga, mas mahusay ang kalidad ng RNA.Well, mas mataas ang antas ng pagkakumpleto.
(2) Kadalisayan ng RNA:Ang ratio ng OD260/280 ay maaaring makita ng UV spectrophotometry.Kung ang ratio ng OD260/280 ay nasa pagitan ng 1.9 at 2.1, ang kadalisayan ay napakahusay.
Ang natitirang genomic DNA ay maaaring humantong sa hindi tumpak na mga resulta ng dami
Kapag na-extract ang RNA, ang RNA na nakukuha natin ay maaaring may halong genomic DNA (gDNA) na hindi pa nalilinis.Samakatuwid, ang cDNA pagkatapos ng reverse transcription ay ihahalo din sagDNA.Habang nasa ibaba ng agosqPCRreaksyon,cDNAat ang gDNA ay maaaring sabay-sabay na palakasin, na nagreresulta sa isang medyo maliit na halaga ng CT, kaya ang mga resulta ay maaaring maging bias.
Kaya ano ang dapat nating gawin sa sitwasyong ito?Foregenenagmumungkahi:
(1) Magsagawa ng paglilinis ng genome sa reversed RNA, na maaaring alisin sa pamamagitan ng column extraction sa panahon ng RNA extraction;
(2) Tratuhin ang nakuhang RNA gamit ang DNaseI , ngunit wakasan ito sa EDTA;
ng reverse transcription reagentsmay genome clearing modules ;

Paano pumili ng mga panimulang aklat para sa reverse transcription?
Naaapektuhan din ng reverse transcription primer ang resulta ng reverse transcription reaction.Maaari kang pumili ng mga random na primer, Oligo dT o gene-specific na primer para sa reverse transcription ayon sa mga partikular na pangyayari ng eksperimento:
(1) Mga partikular na transcript: ang mga primer na partikular sa gene ay inirerekomenda;
(2) Mahabang fragment transcript: Ang Oligo dT/gene-specific primer ay inirerekomenda;
(3) Mga panloob na fragment ng mga transcript na may mahabang segment: gene-specific primers/ random primers /random primers + Oligo dT.Kung isasagawa ang kasunod na eksperimento sa qPCR, hindi maaaring gamitin ang Oligo dT nang mag-isa, dahil ang paggamit ng Oligo dT lamang ay maaaring magdulot ng 3′ end bias , na humahantong sa hindi tumpak na mga resulta ng eksperimento sa qPCR;
(4) miRNA: Maaaring gamitin ang stem-loop primer o tailing primer.

Ilang beses dapat i-diluted ang reverse transcription product na cDNA para sa quantification?
Matapos makuha ang cDNA ng reverse transcription product, kung gaano karaming beses ang cDNA ay dapat na lasaw para sa mga eksperimento sa qPCR ay napakahalaga.Kung ang konsentrasyon ng cDNA ay masyadong mataas o masyadong mababa, ang kahusayan ng amplification ay maaaring maapektuhan.Maaari bang masukat ang konsentrasyon ng cDNA, at paano ito dapat gawin?
(1) Hindi masusukat ang konsentrasyon ng cDNA ng reverse transcription product, dahil bilang karagdagan sa produkto ng cDNA, ang reverse transcription product ay naglalaman din ng reverse transcription residual Buffer, reverse transcriptase, primer, atbp., na makakasagabal sa mga resulta ng pagsukat ng konsentrasyon at magdudulot ng OD260/280, OD260/230 na hindi sumasalamin sa abnormal na ratio ng c.D.NA.Sa oras na ito, sasabihin ng ilang mga kaibigan, pagkatapos ay susukatin ko ang konsentrasyon pagkatapos ng paglilinis;dito, nais ipaalala ni Foregene na ang cDNA ay hindi inirerekomenda na linisin, dahil ang haba ng cDNA na nakuha sa pamamagitan ng pagbabalik ay iba, at ang maikling cDNA ay mawawala sa paglilinis.
(2) Kaya ano ang gagawin?Bago ang eksperimento sa qPCR, ang dilution gradient ng cDNA ay maaaring matukoy sa pamamagitan ng pre-experiment .Halimbawa: gumamit ng cDNA stock solution, 10-fold dilution, at 100-fold dilution bilang mga template para sa qPCR experiments, at piliin ang dilution factor na may CT value sa hanay na 18-28.

Paano dapat i-reverse transcribe ang mga miRNA?
Ang miRNA ay isang single-stranded na maliit na molekula na RNA na may sukat na humigit-kumulang 22 nt na hindi nagko-code para sa protina.Dahil sa maikling haba nito, ang kumbensiyonal na pamamaraan ng qPCR ay mahirap direktang mabilang ito, kaya madalas na kinakailangan upang palawigin ang miRNA;ang karaniwang ginagamit na reverse transcription method para sa miRNA ay kinabibilangan ng stem-loop method at tailing method.
Ang paraan ng stem-loop ay upang pahabain ang miRNA sa pamamagitan ng pagdaragdag ng mga panimulang aklat ng stem-loop.Ang paraan ng pag-detect na ito ay may mas mataas na sensitivity at specificity, ngunit mababa ang detection throughput.Isang reverse transcription lang ang makaka-detect ng isang miRNA at isang internal reference;ang paraan ng pagdaragdag ng buntot ay binubuo ng dalawa Ito ay nakumpleto ng magkasanib na pagkilos ng dalawang enzymes, na PolyA polymerase at reverse transcriptase.Ang PolyA polymerase ay may pananagutan sa pagdaragdag ng PolyA tails sa miRNA upang mapataas ang haba nito, at ang reverse transcriptase ay nagsasagawa ng reverse transcription reaction.Ang pamamaraang ito ay may mataas na pag-detect throughput at maaaring makakita ng maraming miRNA at panloob na sanggunian sa isang reverse transcription, ngunit ang sensitivity at specificity ay mababa sa stem-loop na paraan.