PCR, maramihan PCR, Sa lugar na PCR, Baliktarin ang PCR, RT-PCR, qPCR（1）–PCR

Aayusin natin ang mga konsepto, hakbang at detalye ng iba't ibang PCR

Ⅰ. PCR

Ang Polymerase Chain Reaction, na tinutukoy bilang PCR, ay isang molecular biological na teknolohiya na ginagamit upang palakihin ang mga partikular na fragment ng DNA.Maaari itong ituring bilang isang espesyal na pagtitiklop ng DNA sa vitro.Ang DNA polymerase (DNA Polymerase I) ay natuklasan noong unang bahagi ng 1955, at ang Klenow Fragment ng E. Coli, na may pang-eksperimentong halaga at pagiging praktikal, ay natuklasan ni Dr. H. Klenow noong unang bahagi ng 1970s, ngunit dahil ang enzyme na ito ay hindi pinahihintulutan ang temperatura, ang mataas na temperatura ay maaaring masira ito, kaya hindi ito nakakatugon sa reaksyon ng chain ng polymerasegeneration.Ang mga enzyme na ginagamit ngayon (tinatawag na Taq polymerase), ay ibinukod mula sa Thermus aquaticus, isang hot spring bacterium noong 1976. Ang katangian nito ay na ito ay maaaring lumaban sa mataas na temperatura at isang perpektong enzyme, ngunit ito ay malawakang ginagamit pagkatapos ng 1980s.Ang orihinal na konsepto ng orihinal na primitive prototype ng PCR ay katulad ng pagkumpuni at pagkopya ng gene, na iminungkahi ni Dr. KJell Kleppe noong 1971. Inilathala niya ang unang simple at panandaliang kopya ng gene (katulad ng unang dalawang cycle na reaksyon ng PCR).Ang PCR na binuo ngayon ay binuo ni Dr. Kary B. Mullis noong 1983. Nagsilbi si Dr. Mullis sa mga kumpanya ng PE noong taong iyon, kaya ang PE ay may espesyal na katayuan sa industriya ng PCR.Opisyal na inilathala ni Dr. Mullis ang unang kaugnay na papel kasama si Saiki at iba pa noong 1985. Simula noon, ang paggamit ng PCR ay libu-libong milya sa isang araw, at ang kalidad ng mga kaugnay na papel ay masasabing gumagawa ng maraming iba pang mga pamamaraan ng pananaliksik na hindi kasiya-siya.Kasunod nito, ang teknolohiya ng PCR ay malawakang ginagamit sa biological na siyentipikong pananaliksik at mga klinikal na aplikasyon, na nagiging pinakamahalagang teknolohiya ng pananaliksik sa molecular biology.Nanalo rin si Mullis ng 1993 Nobel Prize sa Chemistry.

PCRPrinsipyo

Ang pangunahing prinsipyo ng teknolohiya ng PCR ay katulad ng natural na proseso ng pagtitiklop ng DNA, at ang pagtitiyak nito ay nakasalalay sa oligonucleotide primer na pantulong sa magkabilang dulo ng target na sequence.Binubuo ang PCR ng degeneration-annealing-extending ng tatlong pangunahing mga hakbang sa reaksyon: ①Degeneration ng template DNA: Pagkatapos na ang template DNA ay pinainit sa humigit-kumulang 93°C para sa isang tiyak na tagal ng panahon, ang dual DNA solution para sa dual-chain DNA na nabuo sa pamamagitan ng PCR amplification ng template DNA Aalis, gawin itong isang solong chain upang ito ay maihahanda para sa susunod na pag-ikot ng reaksyon.②Ang pagsusubo (compound) ng template na DNA at ang primer: Pagkatapos na ang template ng DNA ay pinainit at nabulok sa isang solong chain, ang temperatura ay bumaba sa humigit-kumulang 55°C.Ang pantulong na pagkakasunud-sunod ng panimulang aklat at ang template na DNA single-chain.③Ang extension ng primer: DNA template-ang primer binding ay batay sa pagkilos ng TaqDNA polymerase, na may dNTP bilang reaction raw material.Panatilihin ang prinsipyo ng pagtitiklop, mag-synthesize ng bagong semi-reserved na copy chain na umakma sa template na DNA chain, at ulitin ang cycle degeneration-annealing-extension tatlong proseso ay maaaring makakuha ng mas maraming "semi-reserved copy chain", at ang bagong chain na ito ay magagamit muli Maging isang template para sa susunod na cycle.Ito ay tumatagal ng 2-4min upang makumpleto ang loop, ang target na gene ay maaaring palakihin ng ilang milyong beses sa loob ng 2-3 oras.

PamantayanPCRSistema ng Reaksyon

Limang elemento ng reaksyon ng PCR

Mayroong pangunahing limang uri ng mga sangkap na kasangkot sa reaksyon ng PCR, katulad ng primer, enzyme, dNTP, template at buffer (kinakailangan ang Mg2+).[PCR procedure]

Ang karaniwang proseso ng PCR ay nahahati sa tatlong hakbang

1. Pagkabulok ng DNA (90°C-96°C): Ang mga template ng dual-chain na DNA sa ilalim ng thermal action, ang mga hydrogen bond ay nasira, na bumubuo ng isang single-chain na DNA.

2. Pagsusupil (25 ℃ -65 ℃): Ang temperatura ng system ay nabawasan, ang panimulang aklat ay pinagsama sa template ng DNA upang bumuo ng isang lokal na dual-chain.

3. Extension (70℃ -75℃): Sa ilalim ng pagkilos ng Taq enzyme (mga 72°C, ang pinakamahusay na aktibidad), ang dNTP ay ginagamit bilang hilaw na materyal, na umaabot mula sa 5′ dulo ng primer → 3′ na dulo, synthesis at template na umakma sa isa't isa na DNA chain.

Ang bawat cycle ay denatured, annealed at extended, na nagdodoble sa nilalaman ng DNA.Sa kasalukuyan, dahil sa maikling lugar ng amplification, ang ilang PCR ay maaaring kopyahin sa napakaikling panahon kahit na ang aktibidad ng Taq enzyme ay hindi optimal, kaya maaari itong baguhin sa dalawang hakbang, iyon ay, ang pagsusubo at extension ay maaaring isagawa sa 60°C-65°C sa parehong oras.Upang mabawasan ang proseso ng pag-angat at paglamig at pagbutihin ang bilis ng pagtugon.

Mga tampok ng PCR Reaction

● High-Specificity

Ang mga tiyak na mapagpasyang kadahilanan ng tugon ng PCR ay: ①Ang tiyak na kumbinasyon ng primer at template na DNA.②Ang prinsipyo ng base pairing.③Ang katapatan ng TaqDNA polymerase synthesis reaction.④Ang pagiging tiyak at pagiging konserbatibo ng target na gene.

Ang tamang kumbinasyon ng mga panimulang aklat at mga template ay ang susi.Ang pagbubuklod ng panimulang aklat at ang template at ang extension ng primer na kadena ay batay sa prinsipyo ng pagtutugma ng alkaline base.Ang katapatan ng polymerase synthesis reactions at ang mataas na temperatura na resistensya ng Taq DNA polymerase upang gawin ang pagbubuklod (compound) ng template at primer sa reaksyon ay maaaring maisagawa sa mas mataas na temperatura.Ang pagtitiyak ng kumbinasyon ay lubhang nadagdagan.Ang clip ay maaaring mapanatili ang isang mataas na antas ng kawastuhan.Sa pamamagitan ng pagpili ng isang target na genetic na rehiyon na may mataas na konserbatibo at mataas na pagiging konserbatibo, ang pagiging tiyak nito ay mas mataas.

● Mataas na Sensitivity

Ang dami ng produksyon ng mga produkto ng PCR ay tinataasan ng index, na maaaring palawakin ang panimulang template ng Picker (PG=10-12) upang mapataas ang antas ng microcontroller sa antas ng micrograms (μg= -6).Ang isang target na mga cell ay maaaring makita mula sa 1 milyong mga cell;sa pagtuklas ng mga virus, ang sensitivity ng PCR ay maaaring umabot sa 3 RFUs (empty spot formed units);ang pinakamababang rate ng pagtuklas sa bacterial science ay 3 bacteria.

● Simple at Mabilis

Gumagamit ang pagmumuni-muni ng PCR ng isang mataas na temperatura na Taq DNA polymerase, na nagdaragdag ng solusyon sa reaksyon nang sabay-sabay, iyon ay, isang degeneration-anneal-extension na reaksyon sa solusyon sa amplification ng DNA at palayok ng paliguan ng tubig.Sa pangkalahatan, ang reaksyon ng amplification ay nakumpleto sa loob ng 2 hanggang 4 na oras.Ang mga pinalaki na produkto ay karaniwang sinusuri ng electrical sword, at hindi kailangang gumamit ng isotopes, walang radioactive na polusyon, at madaling promosyon.

● Ang kadalisayan ng ispesimen ay mababa

Hindi na kailangang paghiwalayin ang mga virus o bacteria at mga cell ng kultura.Maaaring gamitin ang mga produktong krudo ng DNA at RNA bilang mga amplifier.Ang pagtukoy ng amplification ng DNA ay maaaring gamitin nang direkta gamit ang mga klinikal na specimen gaya ng dugo, likido sa katawan, likidong panghugas ng ubo, buhok, mga selula, at nabubuhay na tissue.

PCRkaraniwang problema

● False negative, walang amplified bands

Ang mga pangunahing yugto ng reaksyon ng PCR ay kinabibilangan ng: ① paghahanda ng mga template ng nucleic acid, ② kalidad at pagtitiyak ng mga panimulang aklat, ③ kalidad ng mga enzyme ④ kondisyon ng PCR cycle.Ang paghahanap ng dahilan ay dapat ding pag-aralan at pag-aralan para sa mga link sa itaas.

Mga Template: ① Ang template ay naglalaman ng iba't ibang protina, ② Ang template ay naglalaman ng isang Taq enzyme inhibitor, ③ Ang protina sa template ay hindi inaalis, lalo na ang pangkat na protina sa chromosome.⑤ Ang deminer nucleic acid degeneration ay hindi lubusan.Kapag ang kalidad ng mga enzyme at primer ay mabuti, walang amplification band, na malamang na ang digestive treatment ng mga specimens.May mali sa template na proseso ng pagkuha ng nucleic acid, kaya para makapaghanda ng epektibo at matatag na solusyon sa panunaw, dapat ayusin ang pamamaraan nito at hindi basta-basta binago.

Enzyme inactivation: isang bagong enzyme o parehong luma at bagong enzymes ang dapat gamitin nang magkasama upang pag-aralan kung nawala o hindi sapat ang aktibidad ng enzyme, na humahantong sa mga maling negatibo.Dapat pansinin na ang Taq enzyme o ethidium bromide ay minsan nakalimutan.

Primer: ang kalidad ng panimulang aklat, ang konsentrasyon ng panimulang aklat, at kung simetriko ang konsentrasyon ng dalawang panimulang aklat.Ito ay isang karaniwang dahilan para sa pagkabigo ng PCR o ang pagtaas ng banda ay hindi perpekto at madaling kapitan ng pagkalat.May mga problema sa kalidad ng mga panimulang aklat ng ilang batch number.Ang dalawang panimulang aklat ay may mataas na konsentrasyon at mababang konsentrasyon, na nagiging sanhi ng mababang-efficiency na asymmetric amplification.Ang mga countermeasures ay: ① Pumili ng magandang primer para mag-synthesize ng mga unit.② Ang konsentrasyon ng panimulang aklat ay hindi lamang nakadepende sa halaga ng OD, ngunit binibigyang pansin din ang orihinal na likido ng panimulang aklat upang makagawa ng agar sugar gel electrophoresis.Dapat mayroong primer strip zone, at ang liwanag ng dalawang primer ay dapat na pare-pareho sa pangkalahatan.Belt, PCR ay maaaring mabigo sa oras na ito, at dapat itong lutasin gamit ang primer synthesis unit.Kung mataas ang isang panimulang aklat, mababa ang liwanag, at dapat na balanse ang konsentrasyon nito kapag natunaw.③ Ang primer ay dapat bayaran at itago sa mataas na konsentrasyon upang maiwasan ang maramihang pagyeyelo o pangmatagalang bahagi ng pagpapalamig ng refrigerator, na magiging sanhi ng pagkasira at pagkasira ng primer.④ Ang disenyo ng panimulang aklat ay hindi makatwiran, tulad ng haba ng panimulang aklat ay hindi sapat, at ang di cluster ay nabuo sa pagitan ng mga panimulang aklat.

Konsentrasyon ng Mg2+: Ang konsentrasyon ng Mg2+ion ay may malaking epekto sa kahusayan ng PCR amplification.Ang sobrang konsentrasyon ay maaaring mabawasan ang kabaligtaran ng kasarian ng PCR amplification.Kung ang konsentrasyon ay masyadong mababa, ang PCR amplification output ay gagawa ng PCR amplification failure nang walang expansion band.

Pagbabago ng dami ng reaksyon: Ang volume na ginamit sa PCR amplification ay 20ul, 30ul, at 50ul o 100uL, ang malaking volume ng application para sa PCR amplification ay itinakda ayon sa iba't ibang layunin ng siyentipikong pananaliksik at klinikal na pagsubok.Pagkatapos gumawa ng maliliit na volume tulad ng 20ul, kinakailangan na gumawa ng kondisyon ng kurdon kapag ginagawa ang laki, kung hindi, ito ay mabibigo.

Mga pisikal na dahilan: Napakahalaga ng pagbabago para sa PCR amplification.Kung ang temperatura ng pagkabulok ay mababa, ang oras ng pagkabulok ay maikli, ito ay malamang na mangyari sa mga maling negatibo;masyadong mababa ang temperatura ng pagsusubo ay maaaring magdulot ng hindi partikular na amplification at mabawasan ang partikular na kahusayan sa amplification.Lubos na nakakaapekto sa kumbinasyon ng mga panimulang aklat at mga template upang mabawasan ang kahusayan sa amplification ng PCR.Minsan kinakailangan na gumamit ng mga karaniwang thermometer upang makita ang pagkakaiba-iba, pagsusubo at pinalawig na temperatura sa extension o water-soluble cooker, na isa sa mga dahilan ng pagkabigo ng PCR.

Mga variant ng target na sequence: Kung maganap ang target na sequence, isang mutation o pagtanggal, ang kumbinasyon ng prototype at ang template ay pinagsama, o dahil sa kakulangan ng isang target na sequence, ang primer at ang template ay mawawala ang complementary sequence, at ang PCR amplification nito ay hindi magiging matagumpay.

● Maling positibo

Ang PCR amplification band ay lumilitaw na pare-pareho sa target na sequence band, at kung minsan ang banda nito ay mas maayos at mas mataas.

Ang disenyo ng panimulang aklat ay hindi angkop: ang napiling sequence ng amplification at non-purpose amplification sequence ay may homologous, kaya kapag ang PCR amplification, ang mga amplified na produkto ng PCR ay mga non-purposeful sequence.Ang target na sequence ay masyadong maikli o ang primer ay masyadong maikli, at ito ay madaling kapitan ng false positive.Kailangang muling idisenyo.

Cross pollution ng target sequence o amplification na mga produkto: Mayroong dalawang dahilan para sa polusyon na ito: Una, cross-pollution ng buong genome o malalaking segment, na humahantong sa mga false positive.Ang ganitong uri ng maling positibo ay maaaring malutas sa pamamagitan ng mga sumusunod na pamamaraan: Mag-ingat at banayad sa panahon ng operasyon upang maiwasan ang target na sequence na malanghap sa sample gun o tumalsik palabas ng centrifugal tube.Maliban sa mga enzyme at substance na hindi makatiis sa mataas na temperatura, ang lahat ng reagents o kagamitan ay dapat na disimpektahin na may mataas na presyon.Ang mga sentripugal na tubo at mga sample ay dapat gamitin sa isang pagkakataon.Kung kinakailangan, bago magdagdag ng mga specimen, ang reaction tube at reagent ay nakalantad sa ultraviolet rays upang sirain ang umiiral na nucleic acid.Pangalawa, maliliit na fragment sa polusyon sa hangin.Ang maliliit na fragment na ito ay mas maikli kaysa sa target na pagkakasunud-sunod, ngunit mayroon silang tiyak na homology.Maaari itong idugtong sa isa't isa.Matapos mapunan ang mga panimulang aklat, ang produkto ng PCR ay maaaring mapalawak, na magdudulot ng maling positibong produksyon.Maaari itong gamitin upang bawasan o alisin ang nest PCR method.

● Lumitaw na hindi tiyak na amplification band

Ang mga banda na lumitaw pagkatapos ng PCR amplification ay hindi naaayon sa inaasahang laki, o malaki o maliit, o sa parehong oras, o sa parehong oras, mga partikular na amplification band at hindi partikular na amplification band.Ang paglitaw ng mga di-tiyak na banda ay: Una, ang mga panimulang aklat ay hindi kumpleto na pantulong sa target na pagkakasunud-sunod, o ang polimerisasyon ng panimulang aklat upang bumuo ng isang di cluster.Ang pangalawa ay ang konsentrasyon ng MG2+ions ay masyadong mataas, ang annealing temperature ay masyadong mababa, at ang bilang ng mga PCR cycle ay nauugnay.Pangalawa, ang kalidad at dami ng mga enzyme.Kadalasan, ang mga enzyme ng ilang pinagmumulan ay madaling kapitan ng mga hindi espesyal na banda at ang mga enzyme ng ibang pinagmumulan ay hindi nangyayari.Minsan nangyayari din ang hindi tiyak na amplification ng mga enzyme.Ang mga hakbang ay: muling idinisenyo ang mga kaakit-akit kung kinakailangan.Bawasan ang dami ng enzyme o palitan ang enzyme ng ibang pinagmulan.Bawasan ang halaga ng pangunahin, dagdagan ang dami ng mga template nang naaangkop, at bawasan ang bilang ng mga cycle.Tamang taasan ang annealing temperature o gamitin ang dalawang temperature point method (93°C degeneration, annealing at extending sa humigit-kumulang 65°C).

● Lumitaw na patumpik-tumpik na hila o smear tape

Ang PCR amplification kung minsan ay lumilitaw na inilapat o may kabibi o parang karpet na sinturon.Para sa kadahilanang ito, dahil sa labis na dami ng mga enzyme o mahinang kalidad ng enzyme, ang konsentrasyon ng dNTP ay masyadong mataas, ang konsentrasyon ng Mg2+ ay masyadong mataas, ang temperatura ng pagsusubo ay masyadong mababa, at ang bilang ng mga cycle ay masyadong marami.Ang mga hakbang ay: ①Bawasan ang dami ng mga enzyme, o baguhin ang enzyme ng ibang pinagmumulan.②Bawasan ang konsentrasyon ng dNTP ③Bawasan nang maayos ang konsentrasyon ng Mg2+.④Palakihin ang dami ng mga template at bawasan ang bilang ng mga cycle.

Kaugnay na Mga Produkto

PCR Heroᵀᴹ (May Dye)

◮ Mas mataas na katapatan: 6 na beses kaysa sa ordinaryong Taq enzyme;

◮ Mas mabilis na bilis ng amplification

◮ Higit pang kakayahang umangkop sa template

◮ Mas mataas na kahusayan sa amplification

◮ Ang pagpaparaya sa kapaligiran ay mas malakas: inilagay sa 37°C sa loob ng isang linggo, pinapanatili ang higit sa 90% na aktibidad;

◮ Ito ay may 5'→3' DNA polymerase activity at 5'→3' exonuclease activity, walang 3'→5' exonuclease activity.

PCR Easyᵀᴹ (May Dye)

Ang natatanging sistema ng reaksyon at mataas na kahusayan na Taq DNA Polymerase ay ginagawang ang reaksyon ng PCR ay may mas mataas na kahusayan sa amplification, pagtitiyak at pagiging sensitibo.

RT-qPCR Easyᵀᴹ (Isang Hakbang)-SYBR Green I

◮ Ang one-step kit ay gumagawa ng reverse transcription at qPCR ng dalawang reaksyon sa parehong tubo, kailangan lang magdagdag ng template na RNA, mga partikular na PCR primer at RNase-Free ddH₂O.

◮ Ang kit ay mabilis at mahusay na masusuri ang viral RNA o bakas ang RNA.

◮ Ang kit ay gumagamit ng isang natatanging Foregene reverse transcription reagent at Foregene HotStar Taq DNA Polymerase na pinagsama sa isang natatanging sistema ng reaksyon upang epektibong mapabuti ang kahusayan sa amplification at pagiging tiyak ng reaksyon.

◮ Ang na-optimize na sistema ng reaksyon ay ginagawang ang reaksyon ay may mas mataas na sensitivity ng pagtuklas, mas malakas na thermal stability, at mas mahusay na tolerance.

◮ Madaling RT-qPCR^TM(Isang Hakbang)-Ang SYBR Green I kit ay may kasamang ROX internal reference dye, na maaaring gamitin para alisin ang signal background at signal error sa pagitan ng mga balon, na maginhawa para sa mga customer na gamitin sa iba't ibang modelo ng quantitative PCR instruments.

RT Easy^TMII (Master Premix para sa first-strand cDNA synthesis para saReal Time PCR)

-Mahusay na kakayahang mag-alis ng gDNA, na maaaring mag-alis ng gDNA sa template sa loob ng 2 minuto.

-Mahusay na reverse transcription system, tumatagal lamang ng 15 minuto upang makumpleto ang synthesis ng unang strand cDNA.

-Mga kumplikadong template: ang mga template na may mataas na GC na nilalaman at kumplikadong pangalawang istraktura ay maaari ding baligtarin nang may mataas na kahusayan.

-High-sensitivity reverse transcription system, pg-level na mga template ay maaari ding makakuha ng mataas na kalidad na cDNA.

-Ang reverse transcription system ay may mataas na thermal stability, ang pinakamainam na temperatura ng reaksyon ay 42℃, at mayroon pa rin itong magandang reverse transcription performance sa 50℃.