Ang PCR (polymerase chain reaction) ay isa sa mga in-vitro DNA amplification na teknolohiya, na may kasaysayan ng higit sa 30 taon.

Ang teknolohiya ng PCR ay pinasimunuan ni Kary Mullis ng Cetus, USA noong 1983. Nag-apply si Mullis para sa isang PCR patent noong 1985 at inilathala ang unang PCR academic paper sa Science sa parehong taon.Si Mullis ay ginawaran ng Nobel Prize sa chemistry noong 1993 para sa kanyang trabaho.

Mga Pangunahing Prinsipyo ng PCR

Maaaring palakihin ng PCR ang mga target na fragment ng DNA ng higit sa isang milyong beses.Ang prinsipyo ay nasa ilalim ng catalysis ng DNA polymerase, gamit ang parent strand DNA bilang template at partikular na primer bilang panimulang punto para sa extension.Ito ay ginagaya sa vitro sa pamamagitan ng mga hakbang tulad ng denaturation, annealing, at extension.Ang proseso ng daughter strand DNA na pantulong sa parent strand template DNA.

Ang karaniwang proseso ng PCR ay nahahati sa tatlong hakbang:

1. Denaturasyon: Gumamit ng mataas na temperatura upang paghiwalayin ang mga double strand ng DNA.Ang hydrogen bond sa pagitan ng DNA double strands ay nasira sa mataas na temperatura (93-98 ℃).

2.Annealing: Pagkatapos na paghiwalayin ang double-stranded na DNA, babaan ang temperatura upang ang primer ay makagapos sa single-stranded na DNA.

3. Extension: Ang DNA polymerase ay nagsisimulang mag-synthesize ng mga complementary strand sa kahabaan ng DNA strands mula sa mga primer na nakatali kapag ang temperatura ay binabaan.Kapag nakumpleto ang extension, isang cycle ang nakumpleto, at ang bilang ng mga fragment ng DNA ay doble

Ang pag-rereciprocat ng tatlong hakbang na ito ng 25-35 beses, ang bilang ng mga fragment ng DNA ay tataas nang husto.

Ang katalinuhan ng PCR ay ang iba't ibang mga panimulang aklat ay maaaring idisenyo para sa iba't ibang mga target na gene, upang ang mga fragment ng target na gene ay maaaring palakihin sa maikling panahon.

Sa ngayon, ang PCR ay maaaring nahahati sa tatlong kategorya, katulad ng ordinaryong PCR, fluorescent quantitative PCR at digital PCR.

Ang unang henerasyon ng ordinaryong PCR

Gumamit ng isang ordinaryong PCR amplification instrument upang palakihin ang target na gene, at pagkatapos ay gumamit ng agarose gel electrophoresis upang makita ang produkto, tanging pagsusuri ng husay ang maaaring gawin.

Ang mga pangunahing kawalan ng unang henerasyon ng PCR:

1. Mahilig sa hindi partikular na amplification at maling positibong resulta.

2.Ang pagtuklas ay tumatagal ng mahabang panahon at ang operasyon ay mahirap.

3. Tanging qualitative test ang maaaring gawin

Pangalawang henerasyon na Real-Time na PCR

Ang Real-Time PCR, na kilala rin bilang qPCR, ay gumagamit ng fluorescent probe na maaaring magpahiwatig ng pag-unlad ng sistema ng reaksyon, at sinusubaybayan ang akumulasyon ng mga amplified na produkto sa pamamagitan ng akumulasyon ng mga fluorescent signal, at hinuhusgahan ang mga resulta sa pamamagitan ng fluorescence curve.Maaari itong ma-quantified sa tulong ng Cq value at standard curve.

Dahil ang teknolohiya ng qPCR ay isinasagawa sa isang saradong sistema, ang posibilidad ng kontaminasyon ay nabawasan, at ang fluorescence signal ay maaaring subaybayan para sa quantitative detection, kaya ito ang pinaka-tinatanggap na ginagamit sa klinikal na kasanayan at naging nangingibabaw na teknolohiya sa PCR.

Ang mga fluorescent substance na ginagamit sa real-time na fluorescent quantitative PCR ay maaaring nahahati sa: TaqMan fluorescent probe, molecular beacon at fluorescent dye.

1) TaqMan fluorescent probe:

Sa panahon ng PCR amplification, isang partikular na fluorescent probe ang idinaragdag habang nagdaragdag ng isang pares ng primer.Ang probe ay isang oligonucleotide, at ang magkabilang dulo ay may label na isang reporter fluorescent group at isang quencher fluorescent group.

Kapag ang probe ay buo, ang fluorescent signal na ibinubuga ng reporter group ay nasisipsip ng quenching group;sa panahon ng PCR amplification, ang 5′-3′ exonuclease na aktibidad ng Taq enzyme ay pumuputol at nagpapababa sa probe, na ginagawa ang reporter na fluorescent group at quencher Ang fluorescent group ay pinaghihiwalay, upang ang fluorescence monitoring system ay makakatanggap ng fluorescence signal, iyon ay, sa tuwing ang DNA strand ay ganap na pinalaki, ang isang fluorescent na fluorescent na grupo ay nabubuo, at ang molekula ng fluorescent ay nabubuo ng fluorescent. ang produkto ng PCR.

2) SYBR fluorescent dye:

Sa sistema ng reaksyon ng PCR, idinagdag ang labis na SYBR fluorescent dye.Matapos ang SYBR fluorescent dye ay hindi partikular na isinama sa DNA double-strand, naglalabas ito ng fluorescent signal.Ang SYBR dye molecule na hindi kasama sa chain ay hindi maglalabas ng anumang fluorescent signal, at sa gayon ay masisiguro ang fluorescent signal Ang pagtaas sa mga produkto ng PCR ay ganap na naka-synchronize sa pagtaas ng mga produkto ng PCR.Ang SYBR ay nagbubuklod lamang sa double-stranded na DNA, kaya ang melting curve ay magagamit upang matukoy kung ang reaksyon ng PCR ay tiyak.

3) Molecular beacon:

Ito ay isang stem-loop na may double-label na oligonucleotide probe na bumubuo ng istraktura ng hairpin na may humigit-kumulang 8 base sa 5 at 3 dulo.Ang mga pagkakasunud-sunod ng nucleic acid sa magkabilang dulo ay magkatugmang ipinares, na nagiging sanhi ng pagiging mahigpit ng fluorescent group at ang quenching group.Isara, walang fluorescence na gagawin.

Matapos mabuo ang produkto ng PCR, sa panahon ng proseso ng pagsusubo, ang gitnang bahagi ng molecular beacon ay ipinares sa isang tiyak na pagkakasunud-sunod ng DNA, at ang fluorescent gene ay pinaghihiwalay mula sa quencher gene upang makagawa ng fluorescence.

Ang mga pangunahing kawalan ng pangalawang henerasyong PCR:

Kulang pa rin ang pagiging sensitibo, at hindi tumpak ang pagtuklas ng mga specimen na mababa ang kopya.

Mayroong impluwensya ng background na halaga, at ang resulta ay madaling kapitan ng interference.

Kapag may mga PCR inhibitor sa sistema ng reaksyon, ang mga resulta ng pagtuklas ay madaling kapitan ng interference.

Ikatlong henerasyong digital PCR

Kinakalkula ng Digital PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) ang numero ng kopya ng target na sequence sa pamamagitan ng end-point detection, at makakapagsagawa ng tumpak na absolute quantitative detection nang hindi gumagamit ng mga internal na kontrol at karaniwang curve.

Ang digital PCR ay gumagamit ng end-point detection at hindi nakadepende sa Ct value (cycle threshold), kaya ang digital PCR reaction ay hindi gaanong apektado ng amplification efficiency, at ang tolerance sa PCR reaction inhibitors ay napabuti, na may mataas na katumpakan at reproducibility.

Dahil sa mga katangian ng mataas na sensitivity at mataas na katumpakan, hindi ito madaling makagambala ng mga inhibitor ng reaksyon ng PCR, at maaari itong makamit ang tunay na ganap na dami nang walang karaniwang mga produkto, na naging isang research at application hotspot.

Ayon sa iba't ibang anyo ng unit ng reaksyon, maaari itong nahahati sa tatlong pangunahing uri: microfluidic, chip at droplet system.

1) Microfluidic digital PCR, mdPCR:

Batay sa teknolohiyang microfluidic, pinaghihiwalay ang template ng DNA.Maaaring mapagtanto ng microfluidic na teknolohiya ang sample nano-upgrade o ang pagbuo ng mas maliliit na droplet, ngunit ang mga droplet ay nangangailangan ng isang espesyal na paraan ng adsorption at pagkatapos ay pinagsama sa PCR reaction system.Ang mdPCR ay unti-unting pinagtibay ng iba pang mga pamamaraan na palitan.

2) Digital PCR na nakabatay sa droplet, ddPCR:

Gumamit ng water-in-oil droplet generation technology para iproseso ang sample sa mga droplet, at hatiin ang reaction system na naglalaman ng nucleic acid molecules sa libu-libong nanoscale droplets, bawat isa ay hindi naglalaman ng nucleic acid target molecule na matutukoy, o Naglalaman ng isa hanggang ilang nucleic acid target molecule na susuriin.

3) Digital PCR na nakabatay sa chip, cdPCR:

Gamitin ang teknolohiyang pinagsama-samang fluid pathway upang mag-ukit ng maraming microtubes at microcavities sa mga silicon na wafer o quartz glass, at kontrolin ang daloy ng solusyon sa pamamagitan ng iba't ibang control valve, at hatiin ang sample na likido sa mga nanometer na may parehong laki sa mga reaction well para sa digital PCR Reaction upang makamit ang ganap na quantification.

Ang mga pangunahing kawalan ng ikatlong henerasyon ng PCR:

Ang mga kagamitan at reagents ay mahal.

Ang mga kinakailangan sa kalidad ng template ay mataas.Kung ang dami ng template ay lumampas sa dami ng microsystem, ito ay magiging imposible upang mabilang, at kung ito ay masyadong maliit, ang katumpakan ng quantification ay mababawasan.

Ang mga maling positibo ay maaari ding mabuo kapag mayroong hindi partikular na amplification.