Ang COVID-19 ay isang nakakahawang sakit na dulot ng Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus Type 2. Kapag ang isang tao ay nahawahan, ang pinakakaraniwang sintomas ay kinabibilangan ng lagnat, ubo, at igsi ng paghinga.

Ang mga sample na ginamit para sa pagsusuri ay maaaring kolektahin ng nasopharyngeal swab o oropharyngeal swabs.

Ano ang PCR?

Ang karaniwang paraan ng pagtuklas ng coronavirus ay polymerase chain reaction, PCR.Ito ay isang paraan na malawakang ginagamit sa molecular biology.Mabilis nitong makopya ang milyun-milyon hanggang bilyun-bilyong partikular na mga fragment ng DNA.

Ang bagong coronavirus ay naglalaman ng napakahabang single-stranded na RNA genome.Upang matukoy ang mga virus na ito sa pamamagitan ng PCR, ang mga molekula ng RNA ay dapat ma-convert sa kanilang mga pantulong na pagkakasunud-sunod ng DNA sa pamamagitan ng reverse transcriptase, at pagkatapos ay ang bagong synthesize na DNA ay maaaring palakasin ng mga karaniwang pamamaraan ng PCR, na karaniwang kilala bilang RT-PCR.

Proseso ng RT-PCR

Pagkuha ng RNA

Upang maisagawa ang pamamaraang ito, ang viral RNA ay dapat talaga na makuha.Maaaring gamitin ang iba't ibang RNA purification kit para sa maginhawa, mabilis at epektibong paghihiwalay.

Upang kunin ang viral RNA gamit ang isang komersyal na kit, idagdag muna ang sample sa isang microcentrifuge tube at pagkatapos ay ihalo ito sa lysis buffer.Ang buffer na ito ay lubos na na-denatured at kadalasang binubuo ng phenol at guanidine isothiocyanate.Bilang karagdagan, ang mga inhibitor ng RNase ay karaniwang naroroon sa buffer ng lysis upang matiyak ang paghihiwalay ng buo na viral RNA.

Pagkatapos idagdag ang lysis buffer, i-vortex ang mixing tube sa pamamagitan ng pulso at i-incubate sa room temperature.Ang virus ay pagkatapos ay lysed sa ilalim ng mataas na denaturing kondisyon na ibinigay ng lysis buffer.

Pagkatapos ma-lysed ang sample, isang centrifuge tube ang ginagamit para sa purification procedure.Ang sample ay ikinarga sa centrifuge tube at pagkatapos ay i-centrifuge.

Ang pamamaraang ito ay isang solid phase extraction method kung saan ang stationary phase ay binubuo ng isang silica gel matrix.

Sa ilalim ng pinakamainam na kondisyon ng asin at pH, ang mga molekula ng RNA ay nagbubuklod sa silica membrane.

Kasabay nito, ang protina at iba pang mga kontaminado ay tinanggal.

Pagkatapos ng centrifugation, ilagay ang centrifuge tube sa isang malinis na collection tube, itapon ang filtrate, at pagkatapos ay magdagdag ng washing buffer.

Ilagay muli ang tubo sa centrifuge upang pilitin ang wash buffer sa lamad.Aalisin nito ang lahat ng natitirang impurities mula sa lamad, iiwan lamang ang RNA na nakatali sa silica gel.

Pagkatapos mahugasan ang sample, ilagay ang tubo sa isang malinis na microcentrifuge tube at idagdag ang elution buffer.

Pagkatapos ay isentripuga ito upang pilitin ang elution buffer sa pamamagitan ng lamad.Ang elution buffer ay nag-aalis ng viral RNA mula sa spin column at nakakakuha ng purified RNA na walang mga protina, inhibitor, at iba pang contaminants.

HAKBANG 2

Pinaghalong concentrate

Pagkatapos kunin ang viral RNA, ang susunod na hakbang ay ihanda ang reaction mixture para sa PCR amplification.Sa hakbang na ito, concentrate ang ginagamit.Ang concentrated solution na ito ay isang premixed concentrated solution na binubuo ng isang premix, reverse transcriptase, nucleotides, forward primer, reverse primer, TaqMan probe at DNA polymerase.

Sa wakas, upang makumpleto ang pinaghalong reaksyon na ito, idinagdag ang template ng RNA.Ang mga tubo ay halo-halong sa pamamagitan ng pulse vortexing, at pagkatapos ay ang reaksyon na timpla ay ikinarga sa PCR plate.Ang PCR plate ay karaniwang naglalaman ng 96 na balon at maaaring pag-aralan ang maramihang mga sample sa parehong oras.

HAKBANG 3

Pagpapalakas ng PCR

Susunod, ilagay ang plato sa PCR machine, na mahalagang thermal cycler.

Ang real-time na RT-PCR ay ginagamit upang matukoy ang 2019 novel coronavirus sa pamamagitan ng pagpapalakas ng target na sequence sa RdrRP gene, E gene at N gene.Ang pagpili ng target na gene ay depende sa primer at probe sequence.

Ang unang hakbang ng RT-PCR ay reverse transcription.Ang unang strand ng komplementaryong DNA ay na-synthesize, na pinasimulan ng PCR reverse primer, na nagbubuklod sa komplementaryong bahagi ng viral RNA genome.Pagkatapos ay idinaragdag ng reverse transcriptase ang mga nucleotide ng DNA sa 3′end ng primer upang ma-synthesize ang DNA na pantulong sa viral RNA.Ang temperatura at tagal ng hakbang na ito ay nakasalalay sa mga panimulang aklat, target na RNA, at reverse transcriptase na ginamit.

Susunod, inilapat ang isang paunang hakbang ng denaturation, na nagreresulta sa denaturation ng RNA-DNA hybrid.Ang hakbang na ito ay kinakailangan upang maisaaktibo ang DNA polymerase.Kasabay nito, ang reverse transcriptase ay hindi aktibo.

Binubuo ang PCR ng isang serye ng mga thermal cycle.Ang bawat cycle ay binubuo ng denaturation, annealing at extension na mga hakbang.

Ang hakbang sa denaturation ay kinabibilangan ng pag-init ng reaction chamber sa 95 degrees Celsius at paggamit nito para sa denaturation ng double-stranded DNA template.

Sa susunod na hakbang, ang temperatura ng reaksyon ay nababawasan sa 58 degrees Celsius, na nagpapahintulot sa pasulong na primer na ma-anneal sa komplementaryong bahagi ng single-stranded na template ng DNA nito.Ang temperatura ng pagsusubo ay direktang nakasalalay sa haba at komposisyon ng panimulang aklat.

Sa hakbang ng extension, ang DNA polymerase ay nag-synthesize ng bagong DNA strand na pantulong sa DNA template strand.Sa pamamagitan ng pagdaragdag ng libreng nuclei na pantulong sa template sa 5′to 3′direksyon mula sa pinaghalong reaksyon.Ang temperatura ng hakbang na ito ay depende sa DNA polymerase na ginamit.

Pagkatapos ng unang cycle, isang double-stranded na target ng DNA ay nakuha.

Pagkatapos, ipasok ang pangalawang cycle.Ang double-stranded na DNA ay na-denatured para makabuo ng dalawang single-stranded na molekula ng DNA.

Sa susunod na hakbang, ang temperatura ng reaksyon ay ibinababa, ang mga panimulang aklat ay na-annealed sa bawat single-stranded na template ng DNA, at ang Taq-man probe ay na-annealed sa komplementaryong bahagi ng target na DNA.

Ang TaqMan probe ay binubuo ng isang fluorophore covalently linked sa 5′end ng oligonucleotide probe.Kapag nasasabik sa ilaw na pinagmumulan ng cycler, ang fluorophore ay naglalabas ng fluorescence.Bilang karagdagan, ang probe ay binubuo ng isang quencher sa 3′end.Ang kalapitan ng reporter gene sa quencher ay pumipigil sa pagtuklas ng fluorescence.

Sa hakbang ng extension, ang DNA polymerase ay nag-synthesize ng isang bagong strand.Kapag naabot ng polymerase ang TaqMan probe, ang endogenous 5′nuclease na aktibidad nito ay humihiwalay sa probe, na naghihiwalay sa dye mula sa quencher.

Sa bawat cycle ng PCR, mas maraming dye molecule ang inilalabas, na nagreresulta sa pagtaas ng fluorescence intensity na proporsyonal sa bilang ng mga amplicon na na-synthesize.

Ang pamamaraang ito ay nagbibigay-daan sa pagtatantya ng bilang ng isang naibigay na pagkakasunod-sunod na naroroon sa sample.Ang bilang ng mga double-stranded na fragment ng DNA ay doble sa bawat cycle.Samakatuwid, ang PCR ay maaaring gamitin upang pag-aralan ang napakaliit na mga sample.

Para sa pagsukat ng fluorescent signal, tungsten halogen lamp, excitation filter, reflector, lens, emission filter at charge coupled device-use CCD camera.

HAKBANG 4 Alamin

Para sa pagsukat ng fluorescent signal, tungsten halogen lamp, excitation filter, reflector, lens, emission filter at charge coupled device-use CCD camera.

Ang na-filter na liwanag mula sa lampara ay sinasalamin ng reflector, dumadaan sa condenser lens, at nakatutok sa gitna ng bawat butas.Pagkatapos ang fluorescence na ibinubuga mula sa butas ay makikita mula sa salamin, dumadaan sa emission filter, at nakita ng CCD camera.Sa bawat PCR cycle, ang self-excited fluorophore light ay maaaring makita ng CCD.

Kino-convert nito ang nakuhang liwanag sa digital data.Ang pamamaraang ito ay tinatawag na real-time na PCR, at pinapayagan nito ang real-time na pagsubaybay sa pag-unlad ng reaksyon ng PCR.