Ang bawat tao'y nagsasalita tungkol sa prinsipyo ng qRT-PCR na eksperimento, panimulang disenyo, interpretasyon ng resulta, atbp., ngunit sa palagay ko dapat kong ibahagi sa iyo ang eksperimentong operasyon ng qRT-PCR.Ito ay maliit, ngunit ito ay tungkol sa mga resulta.
Bago gawin ang qRT-PCR, kailangan nating magkaroon ng malinaw na pag-unawa sa sarili nating RNA at mga pamamaraan ng operasyon.Pagkatapos ng lahat, ang aming mga pagsisikap ay naglalayong makakuha ng mga resulta, sa halip na simpleng pagsasanay.Kaya bago gawin ang qRT-PCR, kailangan nating tukuyin ang mga sumusunod na isyu (ang ilan sa mga ito ay naaangkop lamang sa SYBR).
1 Sigurado ka bang hindi nasira ang iyong RNA?
Maaari lamang makita ng NanoDrop 2000 ang konsentrasyon at kadalisayan ng RNA, ngunit hindi matukoy ang integridad ng RNA.
Ang halaga ng RNA (RNA Intesity Number) ay maaaring sumasalamin sa integridad ng RNA, na nakita ng Agilent 2100 Bioanalyzer system.
Fig. Schematic diagram ng mga halaga ng RIN para sa iba't ibang sample ng RNA (eukaryotes)
Gayunpaman, ang mga laboratoryo sa pangkalahatan ay walang Agilent 2100 Bioanalyzer.Sa kasong ito, maaari naming makita sa pamamagitan ng formaldehyde gel, ngunit ang kinakailangan para sa kabuuang halaga ng RNA ay mataas, kaya ang pinakamabilis na paraan ay ang paggamit ng ordinaryong gel electrophoresis.Kinakailangan na nasa isang kapaligirang walang nuclease, kaya kinakailangang banlawan ang tangke ng electrophoresis, sol bottle, gel bracket at suklayin ng tubig ng DEPC.Ang agarose ay nuclease-free din (hangga't ito ay bagong bukas), at ang Loading Buffer ay dapat na bagong buksan hangga't maaari, na may 1.2% na gel.
Tandaan na ang gel ay dapat na ganap na matunaw, kung hindi man ito ay magiging sanhi ng hindi magkakatulad na mga banda, tulad ng ipinapakita sa sample 9 sa figure.Kung ang boltahe ay masyadong mataas o tumatakbo nang masyadong mahaba ay bubuo ng init at magiging sanhi ng pagkasira ng RNA, kaya ang boltahe at oras ay dapat na kontrolado nang makatwiran.Bilang karagdagan, ang pagpapatakbo ng gel ay maaari ring higit na matukoy kung mayroong nalalabi sa DNA sa sample, at obserbahan kung mayroong isang malaking bilang ng mga nananatiling banda sa dispensing well.
Pigura.Ang pagtuklas ng gel electrophoresis ng RNA
2 Sigurado ka ba sa konsentrasyon ng iyong cDNA?
Ang karanasan ng malalaking kapatid sa laboratoryo ay ang cDNA ng 20 ul system na nakuha ng bawat inversion ay direktang natunaw ng 20X, habang ang mga post-doctoral na babae ay natunaw ng 10X.Karaniwan akong nakasalalay sa sitwasyon.Dahil iba-iba ang kalidad ng RNA na binanggit ng bawat tao, iba rin ang antas ng pagbaliktad, at maaaring hindi stable ang teknolohiya ng pagbaliktad.
Kaya sa tuwing nakukuha ko ang reversed cDNA, dilute ko muna ito ng mga 3 beses, at pagkatapos ay gagamitin ang housekeeping gene para gawin ang RT-PCR, ang bilang ng mga cycle ay karaniwang 25 cycle, para matukoy ang tiyak na konsentrasyon, at pagkatapos ay matukoy ang panghuling dilution factor.
3 Sigurado ka bang madaling gamitin ang iyong mga panimulang aklat?
Maaari itong pumasa sa melting curve ng qRT-PCR, ngunit nagkakahalaga pa rin ito ng pera.Para sa mga laboratoryo na walang malaking pera, kapag nakakuha sila ng maraming primer, maaari nilang gamitin ang ordinaryong RT-PCR upang makita kung ito ay isang solong banda at matukoy ang pagiging tiyak ng mga primer.Kung ang laboratoryo ay hindi kapos sa pera, ang pagiging tiyak ng lahat ng mga panimulang aklat ay maaaring makilala nang isang beses sa pamamagitan ng melting curve.
4 Sigurado ka bang angkop ang iyong mga pang-eksperimentong kundisyon?
Ang SYBR ay dapat na protektado mula sa malakas na liwanag, kaya subukang patayin ang overhead na ilaw kapag nagdaragdag ng SYBR reagent, at kailangan lang gumamit ng dim light upang makumpleto ito.
Itabi ang SYBR sa 4°C.Kapag ginagamit, dahan-dahang baligtarin pataas at pababa upang ihalo nang mabuti upang maiwasan ang pagbubula, at huwag mag-vortex nang malakas.
Ang ilang mga nakababatang kapatid na babae ay gustong gumuhit ng mga marka sa PCR board dahil sa takot na paghaluin ang mga sample, na mali.Dahil malaki ang posibilidad na maapektuhan ng iyong mga marker ang koleksyon ng mga fluorescent signal, karaniwang inirerekomenda ko ang mga junior na gumamit ng mga eksperimentong notebook upang tumulong sa memorya, tulad ng ipinapakita sa ibaba.
Pigura.qRT-PCR sample loading diagram
5 Sigurado ka bang tama ang ginagawa mo?
Siguraduhing magsuot ng guwantes, magsuot ng guwantes, magsuot ng guwantes, at magsabi ng mahahalagang bagay nang tatlong beses.
Upang mabawasan ang pagkakalantad ng SYBR sa liwanag, gusto ko munang magdagdag ng template, tulad ng ipinapakita sa figure sa ibaba.Ayon sa karanasan, ang pagdaragdag ng isang maliit na halaga ng template ay malamang na magdulot ng mga error sa pag-sample.Samakatuwid, upang mabawasan ang error na dulot ng pagdaragdag ng isang maliit na halaga ng template, karaniwan kong doblehin muli ang sample, at doble ang halaga kapag nagdadagdag ng sample upang mabawasan ang dami ng idinagdag na H2O2.
Pigura.Schematic diagram ng qRT-PCR loading
Pagkatapos ay i-configure ang qRT-PCR system tulad ng sumusunod.
Pigura.qRT-PCR system preparation diagram
TANDAAN: Ang proseso ng pagsasaayos ay kailangang gawin sa yelo.
Pagkatapos idagdag ang sample, idikit ang transparent sealing film.Subukang huwag hawakan ang ibabaw ng transparent na sealing film gamit ang iyong mga kamay, gumana lamang mula sa espasyo sa magkabilang panig ng pelikula.Dahil ang mga fingerprint ay maaari ring makaapekto sa koleksyon ng mga fluorescent signal.Pagkatapos ay gumamit ng centrifuge upang mabilis na mag-centrifuge sa loob ng 10 s sa mababang bilis upang maiwasan ang sample na sumabit sa dingding.
Kaugnay na Mga Produkto:
Oras ng post: Abr-28-2023
