Bilang bago sa laboratoryo, hindi magandang trabaho ang pag-screen out ng mga positibong halaman mula sa isang grupo ng mga halaman na may mababang rate ng conversion.Una, ang DNA ay dapat na kinuha mula sa isang malaking bilang ng mga sample nang paisa-isa, at pagkatapos ay ang mga dayuhang gene ay makikita ng PCR.Gayunpaman, ang mga resulta ay madalas na mga blangko at banda na may ilang mga item paminsan-minsan, ngunit imposibleng matukoy kung may mga napalampas na pagtuklas o maling pagtuklas..Napakawalang magawa ba na harapin ang gayong eksperimentong proseso at mga resulta?Huwag mag-alala, tinuturuan ka ni kuya kung paano i-screen ang mga transgenic positive na halaman nang madali at tumpak.

Hakbang 1

Mga panimulang aklat sa pagtuklas ng disenyo

Tukuyin ang endogenous gene at exogenous gene na matutukoy ayon sa sample na susuriin, at pumili ng kinatawan na 100-500bp sequence sa gene para sa panimulang disenyo.Maaaring matiyak ng magagandang primer ang katumpakan ng mga resulta ng pagtuklas at paikliin ang oras ng pagtuklas (tingnan ang apendiks para sa mga karaniwang ginagamit na primer ng pagtuklas).

Paunawa: Kailangang i-optimize ng mga bagong idinisenyong primer ang mga kondisyon ng reaksyon at i-verify ang katumpakan, katumpakan at limitasyon ng pagtuklas ng pagtuklas bago ang malawakang pagtuklas.

Hakbang 2

Idisenyo ang eksperimentong protocol

Positibong kontrol: Gamitin ang purified DNA na naglalaman ng target na fragment bilang template para matukoy kung normal ang PCR reaction system at mga kundisyon.

Negatibo/blangko na kontrol: Gamitin ang DNA template o ddH2O na hindi naglalaman ng target na fragment bilang template para makita kung may pinagmumulan ng kontaminasyon sa PCR system.

Internal na reference control: gamitin ang primer/probe na kumbinasyon ng endogenous gene ng sample na susuriin upang suriin kung ang template ay maaaring makita ng PCR.

Paunawa:

Ang mga positibo, negatibo/blangko na kontrol at mga kontrol sa panloob na kontrol ay dapat itakda para sa bawat pagsubok upang masuri ang bisa ng mga resultang pang-eksperimento.

Paghahanda ng eksperimento

Bago gamitin, obserbahan kung ang solusyon ay pantay na halo-halong.Kung natagpuan ang pag-ulan, kailangan itong matunaw at ihalo ayon sa mga tagubilin bago gamitin.Ang 2×PCR mix ay kailangang i-pipette at ihalo nang paulit-ulit sa isang micropipette bago gamitin upang maiwasan ang hindi pantay na pamamahagi ng ion.

Paunawa:

Kunin ang manwal at basahin itong mabuti, at gumawa ng mga paghahanda bago ang eksperimento nang mahigpit na alinsunod sa mga kinakailangan ng manwal.

Hakbang 4

Maghanda ng PCR reaction system

Ayon sa eksperimental na protocol, paghaluin ang mga primer, H2O, at 2×PCR ihalo nang pantay-pantay, centrifuge at ipamahagi ang mga ito sa bawat reaction tube.

Paunawa:

Para sa malakihan o pangmatagalang pagsubok, inirerekomendang gumamit ng PCR reaction system na naglalaman ng UNG enzyme, na epektibong makakaiwas sa kontaminasyon ng aerosol na dulot ng mga produktong PCR.

Hakbang 5

Magdagdag ng template ng reaksyon

Gamit ang Direct PCR technology, hindi na kailangan ang nakakapagod na proseso ng nucleic acid purification, ang sample template ay maaaring ihanda sa loob ng 10 minuto, at ang kaukulang PCR reaction system ay maaaring idagdag.

Paunawa:

Ang paraan ng cleavage ay may mas mahusay na epekto ng pagtuklas, at ang nakuhang produkto ay maaaring gamitin para sa maramihang mga reaksyon ng pagtuklas.

5.1: Direktang pagpapalawak ng mga dahon

Ayon sa laki ng larawan sa manual, gupitin ang tissue ng dahon na may diameter na 2-3mm at ilagay ito sa PCR reaction system.

Tandaan: Tiyakin na ang mga fragment ng dahon ay ganap na nalulubog sa PCR reaction solution, at huwag magdagdag ng labis na tissue ng dahon.

5.2: Paraan ng paghahati ng dahon

Gupitin ang tissue ng dahon na may diameter na 5-7mm at ilagay ito sa isang centrifuge tube.Kung pipiliin mo ang mga mature na dahon, mangyaring iwasan ang paggamit ng mga tisyu ng pangunahing ugat ng dahon.Pipette 50ul Buffer P1 lysate sa isang centrifuge tube upang matiyak na ang lysate ay maaaring ganap na isawsaw ang dahon tissue, ilagay ito sa isang thermal cycler o isang metal bath, at lyse sa 95°C para sa 5-10 minuto.

Magdagdag ng 50ul Buffer P2 neutralization solution at haluing mabuti.Ang resultang lysate ay maaaring gamitin bilang isang template at idinagdag sa PCR reaction system.

Tandaan: Ang halaga ng template ay nasa pagitan ng 5-10% ng PCR system, at hindi dapat lumampas sa 20% (halimbawa, sa isang 20μl PCR system, magdagdag ng 1-2μl ng lysis solution, hindi hihigit sa 4μl).

Hakbang 6

Reaksyon ng PCR

Pagkatapos i-centrifuging ang PCR reaction tube, inilalagay ito sa isang PCR instrument para sa amplification.

Paunawa:

Gumagamit ang reaksyon ng non-purified template para sa amplification, kaya ang bilang ng mga amplification cycle ay 5-10 higit pang cycle kaysa kapag gumagamit ng purified DNA template.

Hakbang 7

Electrophoresis detection at pagsusuri ng resulta

M: 100bp DNA Ladder

1\4: Paraan ng purified DNA

2\5: Direktang paraan ng PCR

3\6: Blangkong kontrol

QC:

Ang mga resulta ng pagsubok ng iba't ibang mga kontrol na itinakda sa eksperimento ay dapat matugunan ang mga sumusunod na kundisyon.Kung hindi, ang sanhi ng problema ay dapat na masuri, at ang pagsubok ay dapat isagawa muli pagkatapos na maalis ang problema.

Talahanayan 1. Normal na resulta ng pagsubok ng iba't ibang control group

*Kapag ginamit ang plasmid bilang positibong kontrol, maaaring negatibo ang resulta ng endogenous gene test

Paghuhusga ng resulta:

A. Ang resulta ng pagsubok ng endogenous gene ng sample ay negatibo, na nagpapahiwatig na ang DNA na angkop para sa ordinaryong PCR detection ay hindi maaaring makuha mula sa sample o ang nakuhang DNA ay naglalaman ng PCR reaction inhibitors, at ang DNA ay dapat na kunin muli.

B. Ang resulta ng pagsubok ng endogenous gene ng sample ay positibo, at ang resulta ng pagsubok ng exogenous gene ay negatibo, na nagpapahiwatig na ang DNA na angkop para sa ordinaryong PCR detection ay nakuha mula sa sample, at maaaring husgahan na ang XXX gene ay hindi nakita sa sample.

C. Ang resulta ng pagsubok ng endogenous gene ng sample ay positibo, at ang resulta ng pagsubok ng exogenous gene ay positibo, na nagpapahiwatig na ang DNA na angkop para sa ordinaryong PCR detection ay nakuha mula sa sample, at ang sample na DNA ay naglalaman ng XXX gene.Ang mga eksperimento sa pagkumpirma ay maaaring isagawa pa.

Hakbang 8

Mga panimulang aklat sa pagtuklas ng disenyo

Pagkatapos ng eksperimento, gumamit ng 2% sodium hypochlorite solution at 70% ethanol solution para punasan ang experimental area para maiwasan ang polusyon sa kapaligiran.