Pangkalahatang-ideya
Mabilis na pagkilala sa mga transgenic na halaman
Text/Tong Yucheng
Eksperimental na operasyon/Han Ying
Editor/Wen Youjun
Words/1600+
Iminungkahing oras ng pagbabasa/8-10 minuto
Mabilis na pagkilala sa mga transgenic na halaman
Bilang isang bagong dating sa laboratoryo, hindi magandang trabaho ang pag-screen out ng mga positibong halaman mula sa isang grupo ng mga halaman na may mababang rate ng conversion.Una, ang DNA ay dapat na kinuha mula sa isang malaking bilang ng mga sample nang paisa-isa, at pagkatapos ay ang mga dayuhang gene ay makikita ng PCR.Gayunpaman, ang mga resulta ay madalas na mga blangko at banda na may ilang mga item paminsan-minsan, ngunit imposibleng matukoy kung may mga napalampas na pagtuklas o maling pagtuklas..Napakawalang magawa ba na harapin ang gayong eksperimentong proseso at mga resulta?Huwag mag-alala, tinuturuan ka ni kuya kung paano i-screen ang mga transgenic positive na halaman nang madali at tumpak.
Hakbang 1: Mga panimulang aklat sa pagtuklas ng disenyo
Tukuyin ang endogenous gene at exogenous gene na matutukoy ayon sa sample na susuriin, at pumili ng kinatawan na 100-500bp sequence sa gene para sa panimulang disenyo.Maaaring matiyak ng magagandang primer ang katumpakan ng mga resulta ng pagtuklas at paikliin ang oras ng pagtuklas (tingnan ang apendiks para sa mga karaniwang ginagamit na primer ng pagtuklas).
Tandaan:
Kailangang i-optimize ng mga bagong idinisenyong primer ang mga kundisyon ng reaksyon at i-verify ang katumpakan, katumpakan, at limitasyon ng pagtuklas ng pagtuklas bago magsagawa ng malakihang pagtuklas.
Hakbang 2:Bumuo ng eksperimentong protocol
Positibong kontrol: Gamitin ang purified DNA na naglalaman ng target na fragment bilang template para matukoy kung normal ang PCR reaction system at mga kundisyon.
Negatibo/blangko na kontrol: Gumamit ng DNA template o ddH2O na hindi naglalaman ng target na fragment bilang isang template para makita kung may pinagmumulan ng kontaminasyon sa PCR system.
Internal na reference control: gamitin ang primer/probe na kumbinasyon ng endogenous gene ng sample na susuriin upang suriin kung ang template ay maaaring makita ng PCR.
Tandaan:
Ang mga positibo, negatibo/blangko na kontrol at mga kontrol sa panloob na kontrol ay dapat itakda para sa bawat pagsubok upang masuri ang bisa ng mga resultang pang-eksperimento.
Hakbang 3: Paghahanda ng eksperimento
Bago gamitin, obserbahan kung ang solusyon ay pantay na halo-halong.Kung natagpuan ang pag-ulan, kailangan itong matunaw at ihalo ayon sa mga tagubilin bago gamitin.Ang 2×PCR mix ay kailangang i-pipette at ihalo nang paulit-ulit sa isang micropipette bago gamitin upang maiwasan ang hindi pantay na pamamahagi ng ion.
Tandaan:
Kunin ang mga tagubilin at basahin ang mga ito nang mabuti, at gumawa ng mga paghahanda bago ang eksperimento nang mahigpit na alinsunod sa mga tagubilin.
Hakbang 4: Maghanda ng PCR reaction system
Ayon sa eksperimentong protocol, paghaluin ang mga primer, H2O, 2×PCR mix, centrifuge at ipamahagi ang mga ito sa bawat reaction tube.
Tandaan:
Para sa malakihan o pangmatagalang pagsubok, inirerekomendang gumamit ng PCR reaction system na naglalaman ng UNG enzyme, na epektibong makakaiwas sa kontaminasyon ng aerosol na dulot ng mga produktong PCR.
Hakbang 5: Magdagdag ng template ng reaksyon
Gamit ang teknolohiyang Direct PCR, hindi na kailangan ang nakakapagod na proseso ng paglilinis ng nucleic acid.Ang sample na template ay maaaring ihanda sa loob ng 10 minuto at idagdag sa kaukulang PCR reaction system.
Tandaan:
Ang paraan ng Lysis ay may mas mahusay na epekto sa pagtuklas, at ang nakuhang produkto ay maaaring gamitin para sa maramihang mga reaksyon ng pagtuklas.
5.1: Direktang PCR ng mga dahon
Ayon sa laki ng larawan sa manual, gupitin ang tissue ng dahon na may diameter na 2-3mm at ilagay ito sa PCR reaction system.
Tandaan: Tiyakin na ang mga fragment ng dahon ay ganap na nalulubog sa PCR reaction solution, at huwag magdagdag ng labis na tissue ng dahon.
5.2: Paraan ng lysis ng dahon
Gupitin ang tissue ng dahon na may diameter na 5-7mm at ilagay ito sa isang centrifuge tube.Kung pipiliin mo ang mga mature na dahon, mangyaring iwasan ang paggamit ng mga tisyu ng pangunahing ugat ng dahon.Pipette 50ul Buffer P1 lysate sa isang centrifuge tube upang matiyak na ang lysate ay maaaring ganap na isawsaw ang dahon tissue, ilagay ito sa isang thermal cycler o isang metal bath, at lyse sa 95°C para sa 5-10 minuto.
Magdagdag ng 50ul Buffer P2 neutralization solution at haluing mabuti.Ang resultang lysate ay maaaring gamitin bilang isang template at idinagdag sa PCR reaction system.
Tandaan: Ang halaga ng template ay dapat nasa pagitan ng 5-10% ng PCR system, at hindi dapat lumampas sa 20% (halimbawa, sa isang 20μl PCR system, magdagdag ng 1-2μl ng lysis buffer, hindi hihigit sa 4μl).
Hakbang 6: Reaksyon ng PCR
Pagkatapos i-centrifuging ang PCR reaction tube, ilagay ang mga ito sa isang PCR instrument para sa amplification.
Tandaan:
Gumagamit ang reaksyon ng non-purified template para sa amplification, kaya ang bilang ng mga amplification cycle ay 5-10 higit pang cycle kaysa kapag gumagamit ng purified DNA template.
Hakbang 7: Electrophoresis detection at pagsusuri ng resulta
M:100bp DNA Ladder
1\4: Paraan ng purified DNA
2\5: Direktang paraan ng PCR
3\6: Blangkong kontrol
Kontrol sa Kalidad:
Ang mga resulta ng pagsubok ng iba't ibang mga kontrol na itinakda sa eksperimento ay dapat matugunan ang mga sumusunod na kundisyon.Kung hindi, ang sanhi ng problema ay dapat na masuri, at ang pagsubok ay dapat isagawa muli pagkatapos na maalis ang problema.
Talahanayan 1. Normal na resulta ng pagsubok ng iba't ibang control group
*Kapag ginamit ang plasmid bilang positibong kontrol, maaaring negatibo ang resulta ng endogenous gene test
Paghuhusga ng resulta:
A. Ang resulta ng pagsubok ng endogenous gene ng sample ay negatibo, na nagpapahiwatig na ang DNA na angkop para sa ordinaryong PCR detection ay hindi maaaring makuha mula sa sample o ang nakuhang DNA ay naglalaman ng PCR reaction inhibitors, at ang DNA ay dapat na kunin muli.
B. Ang resulta ng pagsubok ng endogenous gene ng sample ay positibo, at ang resulta ng pagsubok ng exogenous gene ay negatibo, na nagpapahiwatig na ang DNA na angkop para sa ordinaryong PCR detection ay nakuha mula sa sample, at maaaring husgahan na ang XXX gene ay hindi nakita sa sample.
C. Ang resulta ng pagsubok ng endogenous gene ng sample ay positibo, at ang resulta ng pagsubok ng exogenous gene ay positibo, na nagpapahiwatig na ang DNA na angkop para sa ordinaryong PCR detection ay nakuha mula sa sample, at ang sample na DNA ay naglalaman ng XXX gene.Ang mga eksperimento sa pagkumpirma ay maaaring isagawa pa.
Hakbang 8: Mga panimulang aklat sa pagtuklas ng disenyo
Pagkatapos ng eksperimento, gumamit ng 2% sodium hypochlorite solution at 70% ethanol solution para punasan ang experimental area para maiwasan ang polusyon sa kapaligiran.
Apendise
Talahanayan 2. Mga karaniwang ginagamit na panimulang aklat para sa pangkalahatang pagtuklas ng PCR ng mga genetically modified na halaman
Dokumento ng sanggunian:
SN/T 1202-2010, Qualitative PCR detection method para sa genetically modified na mga sangkap ng halaman sa pagkain.
Ministri ng Agrikultura Anunsyo 1485-5-2010, Pagsubok sa mga sangkap ng genetically modified na mga halaman at ang kanilang mga produkto-rice M12 at mga derivatives nito.
Oras ng post: Hun-09-2021
