Sterilization ng pipette tip at EP tubes, atbp.
1. Maghanda ng 0.1% (isang ikalibo) DEPC (highly toxic substance) na may deionized na tubig, maingat na gamitin ito sa isang fume hood, at itago ito sa 4°C ang layo mula sa liwanag;
Ang tubig ng DEPC ay purong tubig na ginagamot sa DEPC at isterilisado ng mataas na temperatura at mataas na presyon.Sinubok na walang RNase, DNase at proteinase.
2. Ilagay ang pipette tip at EP tube sa 0.1% DEPC, at tiyaking ang pipette tip at EP tube ay puno ng 0.1% DEP.
3. Protektahan mula sa liwanag, hayaang tumayo, magdamag (12-24h)
4. Ang kahon na naglalaman ng tip at EP tube ay hindi kailangang ibabad sa DEPC.Pagkatapos halos alisin ang tubig ng DEPC sa dulo o EP tube, i-pack ito at balutin ito.
5. 121 degrees Celsius, 30 min
6. 180 degrees Celsius, tuyo ng ilang oras (hindi bababa sa 3 oras)
Tandaan: a.Magsuot ng latex gloves at mask kapag humahawak ng DEPC!b, o walang DEPC sterilization, 130 ℃, 90min autoclave (maraming mga laboratoryo ng mataas na temperatura isterilisasyon nang dalawang beses)
Mga pagsasaalang-alang sa pagkuha ng RNA
Dalawang pangunahing phenomena ng tissue RNA isolation failure
Pagkasira ng RNA at mga nalalabi ng mga dumi sa mga tisyu,patungkol sa degradation, tingnan muna natin kung bakit hindi madaling masira ang RNA na nakuha mula sa mga kulturang selula.Ang mga kasalukuyang RNA extraction reagents ay naglalaman ng lahat ng mga sangkap na mabilis na pumipigil sa RNase.Idagdag ang lysate sa mga naka-culture na mga cell, at ihalo lang ito, ang lahat ng mga cell ay maaaring lubusang ihalo sa lysate, at ang mga cell ay ganap na lysed.Matapos ma-lysed ang mga cell, agad na pinipigilan ng mga aktibong sangkap sa lysate ang intracellular RNase, kaya nananatiling buo ang RNA.Ibig sabihin, dahil ang mga kulturang selula ay madali at ganap na nakipag-ugnayan sa lysate, ang kanilang RNA ay hindi madaling masira;sa kabilang banda, ang RNA sa tissue ay madaling masira dahil ang mga cell sa tissue ay hindi madaling mabilis na makipag-ugnay sa lysate.dahil sa sapat na pakikipag-ugnayan.Kaya,sa pag-aakalang mayroong isang paraan upang gawing isang cell ang tissue habang pinipigilan ang aktibidad ng RNA, ang problema ng pagkasira ay maaaring ganap na malutas.
Ang liquid nitrogen milling ay ang pinaka-epektibong paraan.Gayunpaman, ang paraan ng paggiling ng likidong nitrogen ay napakahirap, lalo na kapag ang bilang ng mga sample ay malaki.Nagbunga ito ng susunod na pinakamagandang bagay: ang homogenizer.AnghomogenizerAng pamamaraan ay hindi isinasaalang-alang ang tanong kung paano pinipigilan ang aktibidad ng RNase bago ang mga cell ay nakipag-ugnayan sa lysate, ngunit sa halip ay nananalangin na ang rate ng pagkagambala ng tissue ay mas mabilis kaysa sa rate kung saan ang intracellular RNase ay nagpapababa ng RN.
Ang epekto ng electric homogenizer ay mas mahusay,at ang epekto ng glass homogenizer ay mahirap, ngunit sa pangkalahatan, ang homogenizer na paraan ay hindi maaaring maiwasan ang marawal na kalagayan phenomenon.Samakatuwid, kung ang pagkuha ay nagpapasama, ang orihinal na electric homogenizer ay dapat gamitin para sa paggiling na may likidong nitrogen;ang orihinal na homogenizer ng salamin ay dapat na palitan sa isang electric homogenizer o direktang giling na may likidong nitrogen.Ang problema ay halos 100% magagawa.malutas.
Ang problema sa nalalabi sa karumihan na nakakaapekto sa mga kasunod na eksperimento ay may mas magkakaibang mga sanhi kaysa sa pagkasira, at ang mga solusyon ay magkaiba.Sa konklusyon,kung mayroong pagkasira o mga natitirang impurities sa tissue, ang paraan ng pagkuha/reagent para sa partikular na pang-eksperimentong materyal ay dapat na i-optimize.Hindi mo kailangang gamitin ang iyong mahahalagang sample para sa pag-optimize: maaari kang bumili ng ilang maliliit na hayop tulad ng isda/manok mula sa merkado, kunin ang kaukulang bahagi ng materyal para sa pagkuha ng RNA, at ang iba pang bahagi para sa pagkuha ng protina – gilingin gamit ang bibig, tiyan at bituka Extract.
Ang target na RNA ng na-extract na RNA ay ginagamit para sa iba't ibang follow-up na eksperimento, at iba ang mga kinakailangan sa kalidad nito
Ang pagtatayo ng library ng cDNA ay nangangailangan ng integridad ng RNA na walang mga residue ng enzyme reaction inhibitors;Northern nangangailangan ng mas mataas na RNA integridad at mas mababang mga kinakailangan para sa enzyme reaksyon inhibitors residues;Ang RT-PCR ay hindi nangangailangan ng masyadong mataas na integridad ng RNA,ngunit pinipigilan ang mga reaksyon ng enzyme.Ang mga kinakailangan sa nalalabi ay mahigpit.Tinutukoy ng input ang output;sa bawat oras na ang layunin ay upang makuha ang pinakamataas na kadalisayan RNA, ito ay nagkakahalaga ng mga tao at pera.
Koleksyon/Imbakan ng Mga Sample
Mga Salik na Nakakaapekto sa Pagkasira Pagkatapos umalis ang sample sa buhay na katawan/o ang orihinal na kapaligiran ng paglago, ang endogenous enzymes sa sample ay magsisimulang pababain ang RNA,at ang degradation rate ay nauugnay sa nilalaman ng endogenous enzymes at temperatura.Ayon sa kaugalian, mayroon lamang dalawang paraan upang ganap na pigilan ang aktibidad ng endogenous enzyme: magdagdag kaagad ng lysate at homogenize nang lubusan at mabilis;gupitin sa maliliit na piraso at agad na i-freeze sa likidong nitrogen.Ang parehong mga diskarte ay nangangailangan ng mabilis na operasyon.Ang huli ay angkop para sa lahat ng mga sample, habang ang una ay angkop lamang para sa mga tisyu na may mababang nilalaman ng mga cell at endogenous enzymes at mas madaling i-homogenize.Sa partikular, ang tissue ng halaman, atay, thymus, pancreas, spleen, utak, taba, tissue ng kalamnan, atbp. ay pinakamahusay na frozen na may likidong nitrogen bago magpatuloy.
Fragmentation at homogenization ng mga sample
Mga Salik na Nakakaapekto sa Pagkasira at Pagbunga ng Sample fragmentation aypara sa masusing homogenization, na para sa kumpleto at kumpletong pagpapalabas ng RNA.Ang mga cell ay maaaring direktang homogenized nang hindi nasira.Ang mga tissue ay maaaring homogenize lamang pagkatapos masira.Ang lebadura at bakterya ay kailangang basagin ng kaukulang mga enzyme bago sila ma-homogenize.Ang mga tissue na may mas mababang endogenous enzyme content at mas madaling homogenization ay maaaring durugin at homogenized sa isang pagkakataon sa lysate ng isang homogenizer;tissue ng halaman, atay, thymus, pancreas, spleen, utak, taba, kalamnan tissue at iba pang mga sample, Ang mga ito ay alinman sa mataas sa endogenous enzymes o hindi madaling homogenized,kaya ang pagkagambala ng tissue at homogenization ay dapat gawin nang hiwalay.Ang pinaka-maaasahan at pinaka-produktibong paraan ng fragmentation ay ang paggiling na may likidong nitrogen, at ang pinaka-maaasahang paraan ng homogenization ay ang paggamit ng isang electric homogenizer.Isang espesyal na tala tungkol sa paggiling gamit ang likidong nitrogen: ang sample ay hindi dapat lasaw sa buong proseso ng paggiling, dahil ang mga endogenous na enzyme ay mas malamang na gumana kapag nagyelo.
Pagpili ng lysate
Nakakaapekto sa kaginhawahan ng operasyon at ang mga kadahilanan ng mga natitirang endogenous na impurities Ang karaniwang ginagamit na mga solusyon sa lysis ay maaaring halos pigilan ang aktibidad ng RNase.Samakatuwid, ang pangunahing punto ng pagpili ng isang solusyon sa lysis ay upang isaalang-alang kasama ang paraan ng paglilinis.May isang pagbubukod:ang mga sample na may mataas na endogenous enzyme content ay inirerekomenda na gumamit ng lysate na naglalaman ng phenol upang mapataas ang kakayahang i-inactivate ang endogenous enzymes.
Pagpili ng paraan ng paglilinis
Mga salik na nakakaapekto sa mga natitirang endogenous impurities, bilis ng pagkuha Para sa mga malinis na sample gaya ng mga cell, ang mga kasiya-siyang resulta ay maaaring makuha sa halos anumang paraan ng paglilinis na nasa kamay.Ngunit para sa maraming iba pang mga sample, lalo na ang mga may mataas na antas ng mga dumi tulad ng mga halaman, atay, bakterya, atbp., ang pagpili ng angkop na paraan ng paglilinis ay napakahalaga.Ang column centrifugal purification method ay may mabilis na bilis ng pagkuha at maaaring epektibong mag-alis ng mga impurities na nakakaapekto sa kasunod na enzymatic reaction ng RNA, ngunit ito ay mahal(Foregene ay maaaring mag-alok ng cost-effective kit, higit pang mga detalye clickdito);gamit ang matipid at klasikong mga pamamaraan ng paglilinis, tulad ng LiCl precipitation, ay maaari ding makakuha ng kasiya-siyang resulta, ngunit ang oras ng operasyon ay mahaba..
"Tatlong Disiplina at Walong Atensyon" para sa RNA Extraction
Disiplina 1:Tapusin ang kontaminasyon ng mga exogenous enzymes.
Tandaan 1:Mahigpit na magsuot ng maskara at guwantes.
Tandaan 2:Ang mga centrifuge tubes, Tip heads, pipette rods, electrophoresis tank, at mga pang-eksperimentong bangko na kasangkot sa eksperimento ay dapat na lubusang itapon.
Tandaan 3:Ang mga reagents/solusyon na kasangkot sa eksperimento, lalo na ang tubig, ay dapat na walang RNase.
Disiplina 2:I-block ang aktibidad ng endogenous enzymes
Tandaan 4:Pumili ng angkop na paraan ng homogenization.
Tandaan 5:Pumili ng angkop na lysate.
Tandaan 6:Kontrolin ang panimulang dami ng sample.
Disiplina 3:Linawin ang iyong layunin sa pagkuha
Tandaan 7:Sa anumang lysate system na lumalapit sa maximum na panimulang halaga ng sample, ang rate ng tagumpay ng pagkuha ay bumababa nang husto.
Tandaan 8:Ang tanging pang-ekonomiyang pamantayan para sa matagumpay na pagkuha ng RNA ay isang tagumpay sa kasunod na mga eksperimento, hindi ang ani.
Nangungunang 10 Pinagmumulan ng Kontaminasyon ng RNase
1. Ang mga daliri ay ang unang pinagmumulan ng mga exogenous enzymes, kaya ang mga guwantes ay dapat na magsuot at palitan ng madalas.Bilang karagdagan, ang mga maskara ay dapat ding magsuot, dahil ang paghinga ay isa ring mahalagang mapagkukunan ng mga enzyme.Ang karagdagang benepisyo ng pagsusuot ng glove mask ay upang protektahan ang nag-eeksperimento.
2. Pipette tip, centrifuge tubes, pipettes – Ang RNase ay hindi maaaring i-inactivate sa pamamagitan lamang ng sterilization, kaya ang pipette tip at centrifuge tubes ay dapat tratuhin ng DEPC, kahit na minarkahan sila bilang DEPC treated.Pinakamabuting gumamit ng pipette na may espesyal na layunin, punasan ito ng 75% na alcohol cotton ball bago gamitin, lalo na ang baras;bilang karagdagan, siguraduhing huwag gumamit ng pangtanggal ng ulo.
3. Ang tubig/buffer ay dapat walang kontaminasyon ng RNase.
4. Kahit man lang ang test table ay dapat punasan ng 75% alcohol cotton balls.
5.Endogenous RNase Lahat ng tissue ay naglalaman ng endogenous enzymes, kaya ang mabilis na pagyeyelo ng mga tissue na may likidong nitrogen ay ang pinakamahusay na paraan upang mabawasan ang pagkasira.Ang paraan ng pag-imbak/paggiling ng likidong nitrogen ay talagang hindi maginhawa, ngunit ito ang tanging paraan para sa mga tisyu na may mataas na antas ng mga endogenous na enzyme.
6. Mga sample ng RNA Ang mga produkto ng pagkuha ng RNA ay maaaring maglaman ng mga bakas ng kontaminasyon ng RNase.
7. Plasmid extraction Ang plasmid extraction ay kadalasang gumagamit ng Rnase para pababain ang RNA, at ang natitirang Rnase ay dapat matunaw kasama ng Proteinase K at i-extract ng PCI.
8. Imbakan ng RNA Kahit na ito ay nakaimbak sa mababang temperatura, ang mga bakas na halaga ng RNase ay magdudulot ng pagkasira ng RNA.Ang pinakamahusay na solusyon para sa pangmatagalang pag-iingat ng RNA ay isang suspensyon ng asin/alkohol, dahil pinipigilan ng alkohol ang lahat ng aktibidad ng enzymatic sa mababang temperatura.
9. Kapag ang mga cation (Ca, Mg) ay naglalaman ng mga ion na ito, ang pag-init sa 80C sa loob ng 5 minuto ay magiging sanhi ng pag-cleaved ng RNA, kaya kung ang RNA ay kailangang painitin, ang preservation solution ay kailangang maglaman ng chelating agent (1mM Sodium Citrate, pH 6.4).
10. Ang mga enzyme na ginamit sa kasunod na mga eksperimento ay maaaring kontaminado ng RNase.
10 Mga Tip para sa Pagkuha ng RNA
1: Mabilis na pigilan ang aktibidad ng RNase.Ang mga sample ay mabilis na nagyelo pagkatapos ng koleksyon, at ang RNase ay hindi aktibo sa pamamagitan ng mabilis na operasyon sa panahon ng lysis.
2: Pumili ng naaangkop na paraan ng pagkuha para sa tissue na may mataas na nilalaman ng ribozyme, at ang adipose tissue ay pinakamahusay na gamitin ang paraan na naglalaman ng phenol.
3: Ang kalidad ng hula ay nangangailangan ng Northern, ang pagtatayo ng library ng cDNA ay nangangailangan ng mataas na integridad, at ang RT-PCR at RPA (Ribonuclease protection assay) ay hindi nangangailangan ng mataas na integridad.Ang RT-PCR ay nangangailangan ng mataas na kadalisayan (mga residu ng enzyme inhibitor).
4: Ang masusing homogenization ay ang susi sa pagpapabuti ng ani at pagbabawas ng degradasyon.
5: Suriin ang integridad ng RNA electrophoresis detection, 28S: 18S = 2: 1 ay isang kumpletong tanda, 1: 1 ay katanggap-tanggap din para sa karamihan ng mga eksperimento.
6: Pag-alis ng DNA para sa RT-PCR, array analysis Pinakamainam na gamitin ang Dnase I para alisin ang DNA.
7: Bawasan ang kontaminasyon ng mga exogenous enzymes - hindi maaaring i-import ang mga enzyme mula sa labas.
8: Kapag nag-concentrate ng nucleic acid na mababa ang konsentrasyon, dapat magdagdag ng co-precipitation reagent.Ngunit upang maiwasan ang co-precipitant na naglalaman ng mga enzyme at kontaminasyon ng DNA.
9: Lubusang matunaw ang RNA, kung kinakailangan, init sa 65C sa loob ng 5 minuto.
angkop na paraan ng imbakan
Maaari itong maimbak sa –20C sa maikling panahon, at sa –80C sa mahabang panahon.Ang unang hakbang sa pagpapabuti ng mga ani ng RNA ay upang mapagtanto na ang nilalaman ng RNA ng iba't ibang mga sample ay lubhang nag-iiba.Mataas na kasaganaan (2-4ug/mg) tulad ng atay, pancreas, puso, katamtamang kasaganaan (0.05-2ug/mg) tulad ng utak, embryo, bato, baga, thymus, ovary, mababang kasaganaan (<0.05ug/mg) mg) tulad ng pantog, buto, taba.
1: Lyse cells para maglabas ng RN – kung hindi ilalabas ang RNA, mababawasan ang yield.Mas mahusay na gumagana ang electric homogenization kaysa sa iba pang paraan ng homogenization, ngunit maaaring kailanganin ding isama sa iba pang paraan, gaya ng liquid nitrogen mashing, enzymatic digestion (Lysozyme/Lyticase)
2: Pag-optimize ng paraan ng pagkuha.Ang pinakamalaking problema sa mga pamamaraan na nakabatay sa phenol ay hindi kumpletong pagsasapin at bahagyang pagkawala ng RNA (ang supernatant ay hindi maaaring ganap na maalis).Ang hindi kumpletong stratification ay dahil sa mataas na nilalaman ng nucleic acid at protina, na maaaring malutas sa pamamagitan ng pagtaas ng dami ng lysate na ginamit o pagbabawas ng dami ng sample.Ang isang hakbang ng pagkuha ng chloroform ay idinagdag sa adipose tissue.Ang pagkawala ng RNA ay maaaring mabawasan sa pamamagitan ng back-pumping o sa pamamagitan ng pag-alis ng organikong layer na sinusundan ng centrifugation.Ang pinakamalaking problema sa column centrifugation-based na pamamaraan ay ang labis na sample.
Mga Tip sa Classic Extraction
1. Phenol purification: Magdagdag ng katumbas na volume ng 1:1 Phenol/Chloroform at ihalo nang masigla sa loob ng 1-2 minuto.Centrifuge sa mataas na bilis sa loob ng 2 minuto.Maingat na alisin ang supernatant (80-90%).Huwag kailanman makarating sa gitnang layer.Ang isang pantay na dami ng solusyon sa reaksyon ay maaaring idagdag sa Phenol/Chloroform at alisin ang supernatant.Ang dalawang supernatant ay maaaring paghaluin para sa nucleic acid precipitation upang mapabuti ang ani.Huwag maging masyadong malumanay kapag naghahalo, at huwag subukang alisin ang lahat ng supernatant.
2. Paghuhugas gamit ang 70-80% ethanol: Sa panahon ng paghuhugas, ang nucleic acid ay dapat na masuspinde upang matiyak na ang natitirang asin ay nahuhugasan.Kasabay nito, kaagad pagkatapos ibuhos ang ethanol, centrifuge sa mataas na bilis ng ilang segundo, at pagkatapos ay alisin ang natitirang ethanol gamit ang isang pipette.I-dissolve pagkatapos tumayo sa temperatura ng kuwarto para sa 5-10 minuto.
11. Pagkuha ng mga espesyal na organisasyon
1. Fibrous tissue: Ang susi sa pagkuha ng RNA mula sa fibrous tissue gaya ng puso/skeletal muscle ay ang ganap na pagkagambala sa tissue.Ang mga tissue na ito ay may mababang density ng cell, kaya ang halaga ng RNA sa bawat yunit ng timbang ng tissue ay mababa, at ito ay pinakamahusay na gumamit ng mas maraming panimulang halaga hangga't maaari.Siguraduhing durugin ang tissue sa ilalim ng nagyeyelong mga kondisyon.
2. Mga tissue na may mataas na nilalaman ng protina/taba: mataas ang nilalaman ng taba sa utak/gulay.Pagkatapos ng PCI extraction, ang supernatant ay naglalaman ng mga puting floccules.Ang supernatant ay dapat na i-extract muli gamit ang chloroform.
3. Mga tissue na may mataas na nucleic acid/ribozyme content: ang spleen/thymus ay may mataas na nucleic acid at ribozyme content.Ang paggiling ng tissue sa ilalim ng mga kondisyon ng pagyeyelo na sinusundan ng mabilis na homogenization ay maaaring epektibong hindi aktibo ang ribozymes.Gayunpaman, kung ang lysate ay masyadong malapot (dahil sa mataas na nilalaman ng nucleic acid), ang PCI extraction ay hindi makakapag-stratify nang epektibo;Ang pagdaragdag ng higit pang lysate ay maaaring malutas ang isyung ito.Maaaring alisin ng maraming PCI extraction ang mas natitirang DNA.Kung ang isang puting precipitate ay nabuo kaagad pagkatapos magdagdag ng alkohol, ito ay nagpapahiwatig ng kontaminasyon ng DNA.Maaaring alisin ng re-extraction na may acidic PCI pagkatapos ng dissolution ang kontaminasyon ng DNA.
4. Plant tissue: Ang tissue ng halaman ay mas kumplikado kaysa tissue ng hayop.Sa pangkalahatan, ang mga halaman ay giniling sa ilalim ng mga kondisyon ng likidong nitrogen, kaya ang pagkasira ng RNA ng mga endogenous na enzyme ay hindi karaniwan.Kung ang problema sa pagkasira ay hindi nalutas, ito ay halos tiyak na sanhi ng mga impurities na nakapaloob sa sample.Ang mga dumi na nakapaloob sa maraming halaman ay hahantong sa mga nalalabi, at ang dahilan ng mga nalalabi ay kadalasan dahil ang mga dumi na ito ay may ilang pagkakatulad sa RNA: ikaw ay namuo at ako ay namuo, at ikaw ay nag-adsorb at ako ay nag-adsorb.Tinutukoy ng mga katangiang ito na sila ay napakalakas na enzyme inhibitors.
Sa kasalukuyan, ang mga komersyal na RNA extraction reagents ay maaaring iakma sa halos lahat ng mga tisyu ng hayop na may maliliit na pagsasaayos, ngunit mayroong ilang mga komersyal na RNA extraction reagents na maaaring angkop para sa karamihan ng mga tisyu ng halaman.Sa kabutihang palad, ang Foregene ay maaaring magbigay ng espesyalmga kit ng pagkuha ng RNA ng halaman, meron kamiPlant Total RNA Isolation kit, Plant Total RNA Isolation kit Plus.Ang huli ay espesyal na idinisenyo para sa mga halaman na may mataas na polysaccharide at polyphenol na nilalaman.Para sa pagkuha ng RNA, ang feedback mula sa mga gumagamit ng lab ay partikular na mabuti.
12. Ang epekto ng pagyeyelo at pagtunaw ng sample Ang nakapirming sample ay maaaring mas malaki, at kailangan itong putulin bago gamitin para sa pagkuha ng RNA.Ang mga sample ay may posibilidad na matunaw (maaaring bahagyang) habang pinuputol.Maaaring kailanganin na timbangin ang mga frozen na sample bago ang pagkuha ng RNA, at tiyak na magaganap ang lasaw sa prosesong ito.Minsan, ang pagtunaw ng sample ay nangyayari din sa panahon ng proseso ng paggiling ng likidong nitrogen;o ang frozen na sample ay direktang idinagdag sa lysate nang walang likidong nitrogen milling, at tiyak na magaganap ang lasaw bago ang kumpletong homogenization.Ipinakita ng mga eksperimento na ang frozen tissue ay mas madaling kapitan ng pagkasira ng RNA sa panahon ng lasaw kaysa sa sariwang tissue.Ang malamang na dahilan: Ang proseso ng freeze-thaw ay nakakagambala sa mga istruktura sa loob ng cell, na ginagawang mas madali para sa mga endogenous na enzyme na direktang makipag-ugnayan sa RNA.
13. Paghusga sa kalidad ng RNA Karaniwan, ang electrophoresis ay ginagamit upang hatulan ang integridad ng RNA, at A260/A280 ay ginagamit upang hatulan ang kadalisayan ng RNA.Sa teorya, ang buo na RNA ay may ratio na 28S:18S = 2.7:1, at binibigyang-diin ng karamihan sa data ang ratio na 28S:18S = 2:1.Ang katotohanan ay halos wala sa RNA na nakuha mula sa mga sample maliban sa mga cell ay nasa 2:1 ratio (ito ay nakuha gamit ang Agilent Bioanalyzer).
Ang mga resulta ng electrophoresis ng RNA ay apektado ng maraming mga kadahilanan, kabilang ang pangalawang istraktura, mga kondisyon ng electrophoresis, sample load, antas ng saturation ng EB, atbp. Gumamit ng katutubong electrophoresis upang matukoy ang RNA at gamitin ang DNA Marker bilang kontrol.Kung malinaw ang 28S sa 2kb at ang 18S sa 0.9kb, at 28S: 18S > 1, matutugunan ng integridad ang mga kinakailangan ng karamihan sa mga susunod na eksperimento.
Ang A260/A280 ay isang indicator na nagdulot ng maraming kalituhan.Una sa lahat, kinakailangang linawin ang orihinal na kahulugan ng tagapagpahiwatig na ito para sa mga nucleic acid: purong RNA, ang A260/280 nito = mga 2.0.Purong RNA ang 'sanhi' at A260/A280 = 2 ang 'epekto'.Ngayon lahat ay gumagamit ng A260/A280 bilang isang 'sanhi', iniisip na "kung A260/A280 = 2, kung gayon ang RNA ay dalisay", na natural na humahantong sa pagkalito.
Kung interesado ka, maaari kang magdagdag ng kaunting reagent na kadalasang ginagamit sa pagkuha, tulad ng phenol, guanidine isothiocyanate, PEG, atbp., sa iyong sample ng RNA, at pagkatapos ay sukatin ang ratio ng A260/A280.Ang katotohanan ay marami sa mga reagents na ginagamit para sa pagkuha ng RNA, pati na rin ang maraming impurities sa sample, ay sumisipsip sa paligid ng A260 at A280, na nakakaapekto sa A260/A280.
Ang pinaka-nakapagtuturo na diskarte sa kasalukuyan ay ang pag-scan ng mga sample ng RNA sa hanay ng 200-300 nm.Ang kurba ng purong RNA ay may mga sumusunod na katangian: ang kurba ay makinis, A230 at A260 ay dalawang inflection point, A300 ay malapit sa 0, A260/A280 = sa paligid ng 2.0, at A260/A230 = sa paligid ng 2.0.Kung hindi available ang data ng pag-scan, dapat ding matukoy ang ratio ng A260/A230, dahil mas sensitibo ang ratio na ito sa pagdadala ng lahat ng impurities na nakakaapekto sa reaksyong enzymatic.Isaalang-alang ang linear range ng device (0.1–0.5 para sa A260).
Mayroong dalawang iba pang kapaki-pakinabang na phenomena: ang ratio ay magiging 0.3 mas mababa kapag ang A260/A280 ay sinusukat sa tubig;habang ang ratio na sinusukat sa 10 mM EDTA ay humigit-kumulang 0.2 na mas mataas kaysa sa sinusukat sa 1 mM EDTA.
Kaugnay na Mga Produkto:
China Plant Total RNA Isolation Kit Manufacturer at Supplier |Foregene (foreivd.com)
Serye ng paghihiwalay ng RNA – Foregene Co., Ltd. (foreivd.com)
Oras ng post: Hul-15-2022
