Ⅰ. Taasan ang sensitivity ng sistema ng reaksyon:

1. Paghiwalayin ang mataas na kalidad na RNA:

Ang matagumpay na synthesis ng cDNA ay nagmumula sa mataas na kalidad na RNA.Dapat tiyakin ng mataas na kalidad na RNA ang hindi bababa sa kabuuang mas mahaba at hindi naglalaman ng mga inhibitor na hindi naglalaman ng mga recording enzyme, gaya ng EDTA o SDS.Tinutukoy ng kalidad ng RNA ang pinakamataas na halaga ng sequence information na maaari mong i-transcribe sa cDNA.Ang pangkalahatang paraan ng paglilinis ng RNA ay isang hakbang na paraan ng paggamit ng isocyanate/acidophenol.Upang maiwasan ang polusyon ng RNase, ang RNA na nahiwalay mula sa isang sample na mayaman sa RNase (tulad ng pancreas) ay nangangailangan ng pag-iimbak ng formaldehyde upang i-save ang mataas na kalidad na RNA, na higit pa para sa pangmatagalang imbakan.Ang RNA na nakuha mula sa atay ng daga ay karaniwang nasira pagkatapos ng isang linggong pag-iimbak sa tubig, habang ang RNA na nakuha mula sa pali ng daga ay nananatiling matatag pagkatapos ng tatlong taong pag-imbak sa tubig.Bilang karagdagan, ang mga transcript na mas malaki sa 4kb ay mas sensitibo upang masubaybayan ang pagkasira ng RNase kaysa sa maliliit na transcript.Upang mapataas ang katatagan ng imbakan na sample ng RNA, ang RNA ay maaaring matunaw sa isang methalmamine ng ion, at maiimbak -70 °C.Ang thylide na ginamit upang i-save ang RNA ay hindi dapat maglaman ng iba't ibang bagay na nagpapababa sa RNA.Ang RNA, na nagmula sa pancreas, ay maaaring i-save sa methalmamine nang hindi bababa sa isang taon.Kapag handa ka nang gumamit ng RNA, maaari mong gamitin ang mga sumusunod na paraan upang mamuo ang RNA: magdagdag ng NaCl sa 0.2m at 4 na beses ang dami ng ethanol, ilagay ang temperatura sa silid sa loob ng 3-5 minuto, at 10,000 × g centrifugal sa loob ng 5 minuto.

2. Gumamit ng reverse transcriptase nang walang aktibidad ng RNaseH (RNaseH-):

Ang mga inhibitor ng RNase ay kadalasang idinaragdag sa reverse transcription reactions upang mapataas ang haba at ani ng cDNA synthesis.Ang RNase inhibitor ay idinagdag sa unang chain synthesis reaction sa pagkakaroon ng mga buffer at pagbabawas ng mga ahente tulad ng DTT dahil ang proseso ng pre-cDNA synthesis ay nagde-denature sa inhibitor, at sa gayon ay naglalabas ng mga nakagapos na RNases na nagpapababa sa RNA.Pinipigilan lamang ng Protein RNase inhibitor ang pagkasira ng RNA ng RNase A, B, C, at hindi pinipigilan ang RNases sa balat, kaya dapat mag-ingat na huwag ipasok ang RNases mula sa mga daliri sa kabila ng paggamit ng mga inhibitor na ito.

Ang reverse transcriptase ay nag-catalyze ng conversion ng RNA sa cDNA.Ang parehong M-MLV at AMV ay may endogenous na aktibidad ng RNaseH bilang karagdagan sa kanilang sariling aktibidad ng polymerase.Ang aktibidad ng RNaseH ay nakikipagkumpitensya sa aktibidad ng polymerase para sa mga heterozygous strand na nabuo sa pagitan ng mga RNA template at DNA primers o cDNA extension strands, at pinapababa ang RNA: RNA strands sa mga DNA complex.Ang mga template ng RNA na pinababa ng aktibidad ng RNaseH ay hindi na magagamit bilang mga epektibong substrate para sa synthesis ng cDNA, na binabawasan ang ani at haba ng synthesis ng cDNA.Kaya ang pag-aalis o lubos na pagbabawas ng aktibidad ng RNaseH ng reverse transcriptase ay magiging malaking pakinabang.

SuperScriptⅡ reverse transcriptase, MMLV reverse transcriptase ng RNaseH- at thermoScript reverse transcriptase, AMV ng RNaseH- ay nagbunga ng mas full-length na cDNA kaysa sa MMLV at AMV.Ang sensitivity ng RT-PCR ay apektado ng dami ng cDNA na na-synthesize.Ang ThermoScript ay mas sensitibo kaysa sa AMV.Ang laki ng mga produktong RT-PCR ay limitado sa pamamagitan ng kakayahan ng reverse transcriptase na mag-synthesize ng cDNA, lalo na kapag nag-clone ng mas malalaking Cdna.Kung ikukumpara sa MMLV, ang SuperScripⅡ ay tumaas nang malaki sa ani ng mahabang produkto ng RT-PCR.Pinapataas din ng reverse transcriptase ng RNaseH- ang thermal stability, kaya ang reaksyon ay maaaring isagawa sa mga temperatura na mas mataas kaysa sa normal na 37-42 ℃.Sa ilalim ng mga iminungkahing kondisyon ng synthesis, ginamit ang oligo(dT) primer at 10μCi [alpha-p]dCTP.Ang kabuuang produksyon ng unang chain ay kinakalkula gamit ang TCA precipitation method.Ang buong-haba na cDNA ay nasuri gamit ang size-sorted strip removal at pagbibilang sa isang alkaline agarose gel.

3. Taasan ang temperatura ng pag-iingat ng init ng reverse transcription：

Ang mas mataas na temperatura ng paghawak ay nakakatulong upang buksan ang pangalawang istraktura ng RNA at mapataas ang ani ng reaksyon.Para sa karamihan ng mga template ng RNA, ang paghawak sa RNA at primer sa 65°C na walang buffer o asin at pagkatapos ay pinalamig ang mga ito nang mabilis sa yelo, inaalis ang karamihan sa mga pangalawang istruktura at pinapayagan ang mga primer na magbigkis.Gayunpaman, ang ilang mga template ay mayroon pa ring pangalawang istraktura, kahit na pagkatapos ng thermal denaturation.Maaaring maisagawa ang amplification ng mga mahihirap na template na ito gamit ang ThermoScript reverse transcriptase at sa pamamagitan ng paglalagay ng reverse transcriptase reaction sa mas mataas na temperatura upang mapabuti ang amplification.Ang mas mataas na temperatura ng paghawak ay maaari ding tumaas ang pagtitiyak, lalo na kapag ang cDNA synthesis ay ginanap gamit ang gene-specific primers (GSPS) (tingnan ang Kabanata 3).Kung gumagamit ng GSP, siguraduhin na ang halaga ng Tm ng primer ay pareho sa inaasahang temperatura ng paghawak.Huwag gumamit ng oligo(dT) at mga random na primer na higit sa 60 ℃.Ang mga random na primer ay kailangang hawakan sa 25 ℃ sa loob ng 10 minuto bago tumaas sa 60 ℃.Bilang karagdagan sa paggamit ng mas mataas na reverse transcription temperature, maaaring mapabuti ang specificity sa pamamagitan ng direktang paglilipat ng RNA/ primer mixture mula sa 65℃ denaturing temperature patungo sa reverse transcription holding temperature at pagdaragdag ng preheated 2× reaction mixture (cDNA thermal initiation synthesis).Nakakatulong ang diskarteng ito na maiwasan ang intermolecular base pairing na nangyayari sa mas mababang temperatura.Ang paggamit ng instrumento ng PCR ay pinapasimple ang maraming mga switch ng temperatura na kinakailangan para sa RT-PCR.

Ang Tth heat stabilized polymerase ay gumaganap bilang DNA polymerase sa presensya ng Mg2+ at RNA polymerase sa presensya ng Mn2+.Maaari itong humawak ng init hanggang sa 65 ℃.Gayunpaman, ang pagkakaroon ng Mn2+ sa panahon ng PCR ay nagpapababa ng katapatan, na ginagawang hindi angkop ang Tth polymerase para sa mataas na katumpakan na amplification, tulad ng cDNA cloning.Bilang karagdagan, ang Tth ay hindi gaanong mahusay sa reverse transcription, na nagpapababa ng sensitivity, at dahil ang isang enzyme ay maaaring magsagawa ng reverse transcription at PCR, ang mga control reaction na walang reverse transcription ay hindi maaaring gamitin upang makilala ang mga amplified na produkto ng cDNA mula sa mga kontaminadong genomic DNA.

4. Additive na nagtataguyod ng reverse transcription：

Ang pagdaragdag ng mga additives, kabilang ang glycerin at DMSO, sa unang reaksyon ng synthesis ng kadena ay maaaring mabawasan ang katatagan ng double strand ng nucleic acid at mapawi ang pangalawang istraktura ng RNA.Hanggang 20% ​​glycerin o 10% DMSO ang maaaring idagdag nang hindi naaapektuhan ang aktibidad ng SuperScriptⅡ o MMLV.Maaari ding tiisin ng AMV ang hanggang 20% ​​glycerol nang hindi binabawasan ang aktibidad.Upang i-maximize ang sensitivity ng RT-PCR sa SuperScriptⅡ reverse transcription reaction, 10% glycerol ay maaaring idagdag at insulated sa 45 ℃.Kung ang 1/10 ng produkto ng retrotranscription-reaksyon ay idinagdag sa PCR, ang konsentrasyon ng gliserol sa reaksyon ng amplification ay 0.4%, na hindi sapat upang pigilan ang PCR.

5. Pagproseso ng RNaseH：

Maaaring mapabuti ang pagiging sensitibo sa pamamagitan ng paggamot sa mga reaksyon ng synthesis ng cDNA na may RNaseH bago ang PCR.Para sa ilang mga template, iniisip na ang RNA sa cDNA synthesis reaction ay pumipigil sa pagbubuklod ng mga amplified na produkto, kung saan ang paggamot sa RNaseH ay maaaring magpapataas ng sensitivity.Sa pangkalahatan, kinakailangan ang paggamot sa RNaseH para sa pagpapalakas ng isang medyo mahabang full-length na template ng target na cDNA, tulad ng tuberous scherosisⅡ na may mababang kopya.Para sa mahirap na template na ito, pinahusay ng RNaseH ang signal na nabuo ng cDNA na synthesize ng SuperScriptⅡ o AMV.Para sa karamihan ng mga reaksyon ng RT-PCR, opsyonal ang paggamot sa RNaseH dahil ang 95℃ na insulated PCR denaturation step ay karaniwang nag-hydrolyze sa RNA mula sa RNA: DNA complex.

6. Mga pinahusay na pamamaraan para sa pag-detect ng maliliit na halaga ng RNA:

Ang RT-PCR ay partikular na mapaghamong kapag maliit na halaga ng RNA ang magagamit.Ang pagdaragdag ng glycogen bilang isang carrier sa panahon ng paghihiwalay ng RNA ay nakakatulong upang mapataas ang ani ng maliliit na sample.Ang isang RNase-free glycogen ay maaaring idagdag kasabay ng Trizol.Ang Glycogen ay nalulusaw sa tubig at maaaring manatili sa bahagi ng tubig na may RNA upang tumulong sa kasunod na pag-ulan.Ang inirerekomendang konsentrasyon ng RNase-free glycogen ay 250μg/ml para sa mga sample na mas mababa sa 50mg ng tissue o 106 cultured cell.

Ang pagdaragdag ng acetylated BSA upang baligtarin ang mga reaksyon ng transkripsyon gamit ang SuperScriptⅡ ay maaaring magpapataas ng sensitivity, at para sa maliit na halaga ng RNA, ang pagbabawas sa dami ng SuperScriptⅡ at pagdaragdag ng 40 unit ng RnaseOut nuclease inhibitor ay maaaring mapabuti ang antas ng pagtuklas.Kung ang glycogen ay ginagamit sa RNA separation, ang pagdaragdag ng BSA o RNase inhibitors upang baligtarin ang mga reaksyon ng transkripsyon gamit ang SuperScriptⅡ ay inirerekomenda pa rin.

Ⅱ. Dagdagan ang pagtitiyak ng RT-PCR

1. cNDA synthesis：

Tatlong magkakaibang pamamaraan ang maaaring gamitin upang simulan ang unang strand cDNA synthesis, at ang relatibong specificity ng bawat pamamaraan ay nakakaapekto sa dami at uri ng cDNA na synthesize.

Ang random na paraan ng panimulang aklat ay ang hindi gaanong tiyak sa tatlong pamamaraan.Ang mga panimulang aklat ay inilalagay sa maraming mga site sa buong transcript upang makagawa ng maikli, bahagyang haba ng cDNA.Ang pamamaraang ito ay kadalasang ginagamit upang makakuha ng 5′ na mga pagkakasunud-sunod ng terminal at cDNA mula sa mga template ng RNA na may mga pangalawang istrukturang rehiyon o sa mga pagtatapos ng mga site na hindi maaaring kopyahin ang reverse transcriptase.Upang makuha ang pinakamahabang cDNA, ang ratio ng mga primer sa RNA sa bawat sample ng RNA ay kailangang matukoy nang empirically.Ang paunang konsentrasyon ng mga random na panimulang aklat ay mula 50 hanggang 250ng bawat 20μl na sistema ng reaksyon.Dahil ang cDNA na na-synthesize mula sa kabuuang RNA gamit ang mga random na primer ay pangunahing ribosomal RNA, ang poly(A)+RNA ay karaniwang pinipili bilang template.

Ang pagsisimula ng Oligo(dT) ay mas tiyak kaysa sa mga random na panimulang aklat.Nag-hybrid ito sa poly(A) tail na matatagpuan sa 3′ end ng mRNA sa karamihan ng mga eukaryotic cells.Dahil ang poly(A)+RNA ay humigit-kumulang 1% hanggang 2% ng kabuuang RNA, ang halaga at pagiging kumplikado ng cDNA ay mas mababa kaysa kung ginamit ang mga random na primer.Dahil sa mataas na pagtitiyak nito, ang oligo(dT) sa pangkalahatan ay hindi nangangailangan ng optimization para sa RNA sa primer ratio at poly(A)+ na seleksyon.Inirerekomenda na gumamit ng 0.5μg oligo(dT) bawat 20μl reaction system.Ang oligo(dT)12-18 ay angkop para sa karamihan ng RT-PCR.Ang ThermoScript RT-PCR System ay nagbibigay ng oligo(dT)20 dahil sa magandang thermal stability nito at angkop para sa mas mataas na temperatura ng paghawak.

Ang mga gene-specific primer (GSP) ay ang pinakamahusay na mga partikular na primer para sa reverse transcription step.Ang GSP ay isang antisense oligonucleoside na maaaring partikular na mag-hybrid sa mga RNA destination sequence, sa halip na i-anneal ang lahat ng Rnas tulad ng mga random na primer o oligo(dT).Ang mga panuntunang ginamit sa pagdidisenyo ng mga primer ng PCR ay nalalapat din sa disenyo ng reverse transcription reaction na GSP.Ang GSP ay maaaring kapareho ng pagkakasunud-sunod ng amplification primer na na-annealed sa dulo ng mRNA3′, o ang GSP ay maaaring idinisenyo upang ma-annealed sa ibaba ng agos gamit ang reverse amplification primer.Para sa ilang mga amplified na bagay, kinakailangan na magdisenyo ng higit sa isang antisense primer para sa matagumpay na RT-PCR dahil maaaring pigilan ng pangalawang istraktura ng target na RNA ang primer na magbuklod.Iminumungkahi na gumamit ng 1pmol antisense GSP sa unang chain synthesis reaction system na 20μl.

2. Taasan ang temperatura ng pag-iingat ng init ng reverse transcription：

Upang lubos na mapakinabangan ang pagtitiyak ng GSP, dapat gamitin ang reverse transcriptase na may mataas na thermal stability.Ang heat-stable na reverse transcriptase ay maaaring i-insulated sa mas mataas na temperatura upang mapataas ang higpit ng reaksyon.Halimbawa, kung ang isang GSP ay na-annealed sa 55°C, hindi ganap na magagamit ang specificity ng GSP kung ang reverse transcription ay ginawa sa 37°C na may mababang rigor gamit ang AMV o M-MLV.Gayunpaman, ang SuperScripⅡ at ThermoScript ay maaaring mag-react sa 50℃ o mas mataas, na nag-aalis ng mga hindi partikular na produkto na ginawa sa mas mababang temperatura.Para sa maximum na pagtitiyak, ang RNA/ primer mixture ay maaaring ilipat nang direkta mula sa 65℃ denaturation temperature patungo sa reverse transcription holding temperature na may pagdaragdag ng preheated 2 x reaction mixture (thermal initiation ng cDNA synthesis).Nakakatulong ito na maiwasan ang pagpapares ng base sa pagitan ng mga molekula sa mababang temperatura.Ang paggamit ng instrumento ng PCR ay pinapasimple ang maraming mga pagbabago sa temperatura na kinakailangan para sa RT-PCR.

3. Bawasan ang genomic DNA contamination:

Ang isang potensyal na kahirapan sa RT-PCR ay ang RNA ay nakakahawa ng genomic DNA.Ang paggamit ng mas mahusay na paraan ng paghihiwalay ng RNA, tulad ng Trizol Reagent, ay binabawasan ang genomic DNA contamination sa mga paghahanda ng RNA.Upang maiwasan ang mga produktong ginawa mula sa genomic DNA, ang RNA ay maaaring tratuhin ng amplification grade DnasⅠ upang alisin ang kontaminadong DNA bago ang reverse transcription.Ang mga sample ay pinananatili sa 65 ℃ sa 2.0mM EDTA sa loob ng 10 min upang wakasan ang DNaseⅠ digestion.EDTA chelates magnesium ions upang maiwasan ang magnesium ion dependent RNA hydrolysis na nangyayari sa mataas na temperatura.

Upang paghiwalayin ang amplified cDNA mula sa genome DNA amplification product, maaaring idisenyo ang mga panimulang aklat na hiwalay na nag-anne sa nakahiwalay na exon.Ang mga produktong PCR na nagmula sa cDNA ay magiging mas maikli kaysa sa mga nakuha mula sa kontaminadong genomic DNA.Ang isang kinokontrol na eksperimento na walang reverse transcription ay ginagawa din sa bawat RNA template upang matukoy kung ang isang partikular na fragment ay mula sa genomic DNA o cDNA.Ang mga produktong PCR na nakuha sa kawalan ng reverse transcription ay nagmula sa genome.

Kaugnay na produkto

Madaling RT-PCR^ᵀᴹAko (Isang Hakbang)

-Ang one-step kit ay nagbibigay-daan sa reverse transcription at PCR na maisagawa sa parehong tubo.Kailangan lang nitong magdagdag ng template na RNA, mga partikular na PCR primer at RNase-Free ddH₂O.

-Ang real-time na quantitative analysis ng RNA ay maaaring isagawa nang mabilis at tumpak.

-Ang kit ay gumagamit ng isang natatanging Foregene reverse transcription reagent at Foregene HotStar Taq DNA Polymerase na pinagsama sa isang natatanging sistema ng reaksyon upang epektibong mapabuti ang kahusayan sa amplification at pagtitiyak ng reaksyon.

-Ang na-optimize na sistema ng reaksyon ay ginagawang ang reaksyon ay may mas mataas na sensitivity ng pagtuklas, mas malakas na thermal stability, at mas mahusay na tolerance.

RT Easy II(With GDNase) Master Premix Para sa First-Strand CDNA Synthesis Para sa Real Time PCR With GDNase

-Mahusay na kakayahang mag-alis ng gDNA, na maaaring mag-alis ng gDNA sa template sa loob ng 2 minuto.

-Mahusay na reverse transcription system, tumatagal lamang ng 15 minuto upang makumpleto ang synthesis ng unang strand cDNA.

-Mga kumplikadong template: ang mga template na may mataas na GC na nilalaman at kumplikadong pangalawang istraktura ay maaari ding baligtarin nang may mataas na kahusayan.

-High-sensitivity reverse transcription system, pg-level na mga template ay maaari ding makakuha ng mataas na kalidad na cDNA.

-Ang reverse transcription system ay may mataas na thermal stability, ang pinakamainam na temperatura ng reaksyon ay 42℃, at mayroon pa rin itong magandang reverse transcription performance sa 50℃.