1. Pangunahing kaalaman (kung gusto mong makita ang pang-eksperimentong bahagi, mangyaring direktang ilipat sa pangalawang bahagi)
Bilang derivative reaction ng conventional PCR, ang Real time PCR ay pangunahing sinusubaybayan ang pagbabago ng dami ng amplification product sa bawat cycle ng PCR amplification reaction sa real time sa pamamagitan ng pagbabago ng fluorescence signal, at quantitatively na sinusuri ang panimulang template sa pamamagitan ng relasyon sa pagitan ng ct value at ng standard curve .
Ang tiyak na data ng RT-PCR aybaseline, fluorescence thresholdatCt halaga.
| baseline: | Ang fluorescence value ng 3rd-15th cycle ay ang baseline (baseline), na sanhi ng paminsan-minsang error ng pagsukat. |
| Threshold (threshold): | Tumutukoy sa limitasyon sa pagtuklas ng fluorescence na itinakda sa naaangkop na posisyon sa exponential growth region ng amplification curve, karaniwang 10 beses ang standard deviation ng baseline. |
| Halaga ng CT: | Ito ang bilang ng mga PCR cycle kapag ang fluorescence value sa bawat reaction tube ay umabot sa threshold. Ang halaga ng Ct ay inversely proportional sa halaga ng paunang template. |
Mga karaniwang paraan ng pag-label para sa RT-PCR:
| paraan | kalamangan | pagkukulang | saklaw ng aplikasyon |
| SYBR BerdeⅠ | Malawak na kakayahang magamit, sensitibo, mura at maginhawa | Ang mga kinakailangan sa panimulang aklat ay mataas, madaling kapitan ng mga hindi partikular na banda | Ito ay angkop para sa quantitative analysis ng iba't ibang target na gene, pananaliksik sa gene expression, at pananaliksik sa transgenic recombinant na mga hayop at halaman. |
| TaqMan | Magandang pagtitiyak at mataas na repeatability | Ang presyo ay mataas at angkop lamang para sa mga partikular na layunin. | Ang pagtuklas ng pathogen, pananaliksik sa gene ng paglaban sa gamot, pagtatasa ng pagiging epektibo ng gamot, pagsusuri ng mga genetic na sakit. |
| molekular na beacon | Mataas na pagtitiyak, fluorescence, mababang background | Ang presyo ay mataas, ito ay angkop lamang para sa isang tiyak na layunin, ang disenyo ay mahirap, at ang presyo ay mataas. | Tukoy na pagsusuri ng gene, pagsusuri ng SNP |
2. Mga pang-eksperimentong hakbang
2.1 Tungkol sa pang-eksperimentong pagpapangkat- dapat mayroong maraming mga balon sa grupo, at dapat mayroong biological na pag-uulit.
| ① | Blangkong kontrol | Ginagamit upang makita ang katayuan ng paglaki ng cell sa mga eksperimento |
| ② | Negatibong kontrol na siRNA (hindi partikular na sequence ng siRNA) | Ipakita ang pagtitiyak ng pagkilos ng RNAi.Ang siRNA ay maaaring mag-udyok ng hindi tiyak na tugon ng stress sa isang konsentrasyon na 200nM. |
| ③ | Transfection Reagent Control | Ibukod ang toxicity ng transfection reagent sa mga cell o ang epekto sa pagpapahayag ng target na gene |
| ④ | siRNA laban sa target na gene | Itumba ang pagpapahayag ng target na gene |
| ⑤ (opsyonal) | positibong siRNA | Ginagamit upang i-troubleshoot ang mga pang-eksperimentong sistema at mga problema sa pagpapatakbo |
| ⑥ (opsyonal) | Fluorescent control siRNA | Ang kahusayan ng paglipat ng cell ay maaaring maobserbahan sa isang mikroskopyo |
2.2 Mga prinsipyo ng panimulang disenyo
| Pinalakas na laki ng fragment | Mas mabuti sa 100-150bp |
| Haba ng Primer | 18-25bp |
| Nilalaman ng GC | 30%-70%, mas mabuti 45%-55% |
| Tm halaga | 58-60 ℃ |
| Pagkakasunod-sunod | Iwasan ang tuloy-tuloy na T/C;A/G tuloy-tuloy |
| 3 pagtatapos ng pagkakasunud-sunod | Iwasan ang GC rich o AT rich;ang terminal base ay mas mabuti G o C;pinakamahusay na iwasan ang T |
| Complementarity | Iwasan ang mga pantulong na pagkakasunud-sunod ng higit sa 3 base sa loob ng primer o sa pagitan ng dalawang primer |
| Pagtitiyak | Gumamit ng blast search upang kumpirmahin ang pagtitiyak ng panimulang aklat |
①Ang SiRNA ay partikular sa mga species, at ang mga pagkakasunud-sunod ng iba't ibang mga species ay magkakaiba.
②Ang SiRNA ay nakabalot sa freeze-dried powder, na maaaring maiimbak nang matatag sa loob ng 2-4 na linggo sa temperatura ng silid.
2.3 Mga tool o reagents na kailangang ihanda nang maaga
| Primer (panloob na sanggunian) | Kasama ang pasulong at baligtarin ang dalawa |
| Mga panimulang aklat (target gene) | Kasama ang pasulong at baligtarin ang dalawa |
| Target na Si RNA (3 strips) | Sa pangkalahatan, mag-synthesize ang kumpanya ng 3 strips, at pagkatapos ay pipili ng isa sa tatlo sa pamamagitan ng RT-PCR |
| Kit ng Paglilipat | Lipo2000 atbp. |
| RNA Rapid Extraction Kit | Para sa pagkuha ng RNA pagkatapos ng paglipat |
| Rapid Reverse Transcription Kit | para sa synthesis ng cDNA |
| PCR Amplification Kit | 2×Super SYBR Berde qPCR Master Mix |
2.4 Tungkol sa mga isyu na kailangang bigyang pansin sa mga partikular na pang-eksperimentong hakbang:
①proseso ng paglipat ng siRNA
1. Para sa plating, maaari kang pumili ng 24-well plate, 12-well plate o 6-well plate (ang average na konsentrasyon ng RNA na iminungkahi sa bawat balon ng isang 24-well plate ay humigit-kumulang 100-300 ng/uL), at ang pinakamainam na transfection density ng mga cell ay hanggang 60 %-80% o higit pa
2. Ang mga hakbang sa paglipat at mga partikular na kinakailangan ay mahigpit na naaayon sa mga tagubilin.
3. Pagkatapos ng paglipat, maaaring kolektahin ang mga sample sa loob ng 24-72 oras para sa pagtuklas ng mRNA (RT-PCR) o pagtuklas ng protina sa loob ng 48-96 na oras (WB)
② Proseso ng pagkuha ng RNA
1. Pigilan ang kontaminasyon ng mga exogenous enzymes.Pangunahing kabilang dito ang mahigpit na pagsusuot ng mga maskara at guwantes;gamit ang sterilized pipette tip at EP tubes;ang tubig na ginamit sa eksperimento ay dapat na RNase-Free.
2. Inirerekomenda na gawin nang dalawang beses gaya ng iminungkahing sa quick extraction kit, na talagang magpapahusay sa kadalisayan at ani.
3. Hindi dapat hawakan ng basurang likido ang column ng RNA.
③ Pagsusuri ng RNA
Pagkatapos ma-extract ang RNA, maaari itong direktang ma-quantify gamit ang Nanodrop , at ang pinakamababang pagbabasa ay maaaring kasing baba ng 10ng/ul.
④Baliktarin ang proseso ng transkripsyon
1. Dahil sa mataas na sensitivity ng RT-qPCR, hindi bababa sa 3 parallel na balon ang dapat gawin para sa bawat sample upang maiwasan ang kasunod na Ct na maging masyadong naiiba o ang SD ay masyadong malaki para sa statistical analysis.
2. Huwag i-freeze at lasawin ang Master mix nang paulit-ulit.
3. Ang bawat tubo/butas ay dapat mapalitan ng bagong tip!Huwag patuloy na gamitin ang parehong pipette tip upang magdagdag ng mga sample!
4. Ang pelikulang nakakabit sa 96-well plate pagkatapos idagdag ang sample ay kailangang pakinisin gamit ang isang plato.Pinakamainam na mag-centrifuge bago ilagay ito sa makina, upang ang likido sa dingding ng tubo ay dumaloy pababa at maalis ang mga bula ng hangin.
⑤ Karaniwang pagsusuri ng curve
| Walang panahon ng logarithmic growth | Posibleng mataas na konsentrasyon ng template |
| Walang halaga ng CT | Mga maling hakbang para sa pag-detect ng mga fluorescent signal; pagkasira ng mga primer o probes - ang integridad nito ay maaaring makita ng PAGE electrophoresis; hindi sapat na dami ng template; pagkasira ng mga template - pag-iwas sa pagpapakilala ng mga impurities at paulit-ulit na pagyeyelo at lasaw sa paghahanda ng sample; |
| Ct>38 | Mababang kahusayan ng amplification;Ang produkto ng PCR ay masyadong mahaba;ang iba't ibang mga bahagi ng reaksyon ay nasira |
| Linear amplification curve | Maaaring bahagyang masira ang mga probe sa pamamagitan ng paulit-ulit na freeze-thaw cycle o matagal na pagkakalantad sa liwanag |
| Ang pagkakaiba sa mga duplicate na butas ay partikular na malaki | Ang reaksyong solusyon ay hindi ganap na natutunaw o ang reaksyong solusyon ay hindi pinaghalo;ang thermal bath ng PCR instrument ay kontaminado ng fluorescent substance |
2.5 Tungkol sa pagsusuri ng datos
Ang pagsusuri ng data ng qPCR ay maaaring nahahati sa relatibong quantification at absolute quantification.Halimbawa, ang mga cell sa pangkat ng paggamot kumpara sa mga cell sa control group,
Ilang beses nagbabago ang mRNA ng X gene, ito ay relatibong quantification;sa isang tiyak na bilang ng mga cell, ang mRNA ng X gene
Ilang kopya ang mayroon, ito ay ganap na dami.Kadalasan ang pinaka ginagamit natin sa laboratoryo ay ang relative quantitative method.kadalasan,ang 2-ΔΔct na pamamaraanang pinakamadalas na ginagamit sa mga eksperimento , kaya ang pamamaraang ito lamang ang ipapakilala nang detalyado dito.
Paraan ng 2-ΔΔct: Ang resulta na nakuha ay ang pagkakaiba sa pagpapahayag ng target na gene sa eksperimentong grupo na may kaugnayan sa target na gene sa control group.Kinakailangan na ang mga kahusayan sa amplification ng parehong target na gene at ang panloob na reference gene ay malapit sa 100%, at ang kamag-anak na paglihis ay hindi dapat lumampas sa 5%.
Ang paraan ng pagkalkula ay ang mga sumusunod:
Δct control group = ct value ng target gene sa control group – ct value ng internal reference gene sa control group
Δct experimental group = ct value ng target na gene sa experimental group – ct value ng internal reference gene sa experimental group
ΔΔct=Δct experimental group-Δct control group
Panghuli, kalkulahin ang maramihang pagkakaiba sa antas ng pagpapahayag:
Baguhin ang Fold=2-ΔΔct (naaayon sa excel function ay POWER)
Kaugnay na Mga Produkto:
Oras ng post: Mayo-20-2023
