Hindi kayang tiisin ng mga tradisyunal na reverse transcriptases ang mataas na temperatura (ang pinakamainam na temperatura para sa aktibidad ng MMLV ay 37-50°C, at ang AMV ay 42-60°C).Ang mas kumplikadong viral RNA ay hindi maaaring epektibong i-reverse transcribe sa cDNA sa mababang temperatura, na nagreresulta sa kahusayan sa pagtuklas Ang pagbabawas.Ang tradisyunal na RT-qPCR sa pangkalahatan ay nangangailangan ng pakikilahok ng dalawang pangunahing enzymes (reverse transcriptase at DNA polymerase), na ginagawang imposibleng gawing simple ang operasyon ng sistema ng reaksyon at bawasan ang gastos.Dito ay ipapakilala namin ang dalawang reverse transcriptases na lumalaban sa mataas na temperatura, TtH at RevTaq.Ang dalawang enzyme na ito ay mayroon ding function ng DNA polymerase, kaya tinatawag silang bifunctional enzymes.

TtH DNA polymerase

Marahil ay narinig mo na ang tungkol sa TtH, na nagmula sa thermophilic bacterium na Thermus thermophilus HB8.Sa pagkakaroon ng divalent cations tulad ng Mg2+, mayroon itong aktibidad na DNA polymerase.Ito ay malawakang ginagamit sa mga reaksyon ng PCR tulad ng Taq enzyme, ngunit mayroon itong mas mataas na paglaban sa init kaysa sa Taq enzyme, kaya mayroon din itong mas mahusay na epekto sa PCR na may mataas na mga template ng nilalaman ng GC.

· Ang enzyme na ito ay karaniwang walang 3′→5′ exonuclease activity at 5′→3′ exonuclease activity, kaya maaari din itong gamitin para sa dideoxy sequencing.

· Ang enzyme na ito ay may aktibidad na RTase.Sa pagkakaroon ng Mn2+, ang aktibidad ng RTase ay mapapahusay.Gamit ang feature na ito, maaari itong magamit upang magsagawa ng reverse transcription reaction at PCR reaction sa parehong tubo, iyon ay, one-step RT-PCR.Gayunpaman, sa pagkakaroon ng Mn2+, ang katumpakan ng RT-PCR ay hindi mataas.Ang aktibidad ng RT ay walang kinalaman sa aktibidad ng rnaase H.

· Ang tumaas na aktibidad ng Tth-DNA polymerase (pH9, pinakamabuting kalagayan +55℃～+70℃, maximum +95℃) ay nagtagumpay sa mga problemang dulot ng pangalawang istraktura ng RNA.Ang resultang cDNA ay maaaring palakasin ng PCR na may parehong enzyme sa pagkakaroon ng Mg2+ ions.

· Ang kakayahan ng Tth-DNA polymerase na magsagawa ng reverse transcription at DNA amplification sa mataas na temperatura ay ginagawang kapaki-pakinabang ang enzyme na ito para sa quantitative RT-PCR, cloning, at pagsusuri ng gene expression ng cellular at viral RNA.
· Ang Tth-DNA polymerase ay ginagamit para sa RT-PCR upang palakihin ang RNA hanggang sa 1kb.

Mga tampok at pakinabang

Tth DNA polymerase:

• Tiyakin ang na-optimize na polymerase chain reaction (PCR) na laki ng produkto, hindi bababa sa 1000 bp sa RT-PCR reaction

• Tanggapin ang binagong deoxyribonucleoside triphosphate bilang substrate

• Hindi nauugnay sa aktibidad ng RNase H

• May mataas na thermal stability upang malampasan ang mga problema, kadalasang nauugnay sa mataas na pangalawang istraktura na nasa RNA

RevTaq RT-PCR DNA polymerase

Isang DNA polymerase na lumalaban sa init na may aktibidad na reverse transcriptase

Ang RevTaq-RT-PCR-DNA polymerase ay isang engineered, highly heat-resistant, dual-functional enzyme na may reverse transcriptase at mga aktibidad ng DNA polymerase na nakuha sa pamamagitan ng direktang at artipisyal na ebolusyon.

· Ang kalahating buhay ng RevTaq RT-PCR DNA polymerase sa 95°C ay higit sa 40 minuto.

· Binibigyang-daan ng RevTaq RT-PCR DNA polymerase ang mataas na temperatura na reverse transcription nang direkta mula sa RNA template, at ang reverse transcription step ay maaaring ulitin nang maraming beses upang makabuo ng mas maraming cDNA templates.

· Binibigyang-daan ng RevTaq RT-PCR DNA polymerase ang “zero-step” RT-PCR (walang isothermal reverse transcription step), dahil sa cyclic PCR extension step, ang reverse transcription at DNA amplification ay nangyayari nang sabay-sabay.Itinataguyod din nito ang reverse transcription reaction sa mataas na temperatura, at sa gayon ay pinapaliit ang mga problemang nakatagpo sa pagtunaw ng malakas na pangalawang istraktura sa RNA sa mataas na temperatura.

· Dahil sa aptamer-based na hot-start formula, ang RevTaq RT-PCR DNA polymerase ay magbubunga ng mas mahusay na mga resulta kapag ang annealing at extension na temperatura ay mas mataas sa 57°C.

· Dahil ang enzyme ay lumalaban sa init, inirerekumenda na magdisenyo ng mga panimulang aklat at probe na may napakataas na punto ng pagkatunaw (>60°C).

· Inirerekomenda na i-optimize ang temperatura ng annealing/extension step sa pamamagitan ng temperature gradient sa panahon ng proseso ng pag-setup ng reaksyon.

· Kung mas mataas ang temperatura, mas mataas ang specificity ng PCR.Ang reverse transcription cycle ay karaniwang ginagawa sa mas mataas na temperatura kaysa sa PCR cycle, dahil ang DNA Primer:RNA Template hybridization ay karaniwang may mas mataas na melting point kaysa DNA Primer:cDNA Template duplex.

· Ang RevTaq RT-PCR DNA polymerase ay genetically engineered at na-optimize, at ang laki ng amplicon ay nasa pagitan ng 60-300 bp.

Ang RevTaq RT-PCR DNA polymerase detection limit ay umabot sa 4 na kopya/

Ang na-optimize na sistema ng reaksyon (ang pagtatatag ng mataas na melting point primers) ay ipinapakita sa figure.Ang RevTaq RT-PCR DNA polymerase-driven RT-PCR ay nagpapakita ng mas mahusay na sensitivity kaysa sa TaqPath 1-step RT-qPCR master mix, at mas mababang detection Sample dilution gradient.

Higit pang mga pakinabang:

Mabilis na pagsisimula function → Maaaring laktawan ang paunang hakbang ng thermal denaturation.

Hot-start aptamer formula → Magbigay kaagad ng 100% enzyme activity at maiwasan ang hindi partikular na amplification sa mababang temperatura (<57°C).

Cleavage function → Ang RNA extraction step ay tinanggal, dahil ang RevTaq RT-PCR DNA polymerase ay maaari ding magproseso ng mga crude reaction sample.Maaari nitong sirain kaagad ang mga lamad ng cell ng mga eukaryote, bakterya at mga virus sa isang mainit na siklo ng RT-PCR.

IVD na antas ng hilaw na materyal → mataas na kalidad na mga pamantayan at lubhang mapagkumpitensyang mga presyo