Ang Fluorescence quantitative PCR (kilala rin bilang TaqMan PCR, pagkatapos ay tinutukoy bilang FQ-PCR) ay isang bagong nucleic acid quantitative technology na binuo ng PE (Perkin Elmer) sa United States noong 1995. Ang teknolohiyang ito ay batay sa conventional PCR sa pamamagitan ng pagdaragdag ng fluorescent labeled probes.Kung ikukumpara sa nababaluktot na PCR, ang FQ-PCR ay may maraming mga pakinabang upang mapagtanto ang dami ng function nito.Nilalayon ng artikulong ito na maikling ilarawan ang mga katangian, prinsipyo, pamamaraan, at aplikasyon ng teknolohiya.
1 Mga Tampok
Ang FQ-PCR ay hindi lamang may mataas na sensitivity ng ordinaryong PCR, ngunit dahil din sa aplikasyon ng fluorescent probes, maaari itong direktang makita ang pagbabago ng fluorescent signal sa panahon ng PCR amplification sa pamamagitan ng photoelectric conduction system upang makakuha ng quantitative na mga resulta, na nagtagumpay sa maraming mga pagkukulang ng conventional PCR, kaya mayroon din itong mataas na specificity ng DNA technology hybridization at ang mataas na accuracy ng spectroscopy.
Halimbawa, ang mga pangkalahatang produkto ng PCR ay kailangang obserbahan sa pamamagitan ng agarose gel electrophoresis at ethidium bromide staining na may ultraviolet light o sa pamamagitan ng polyacrylamide gel electrophoresis at silver staining.Hindi lamang ito nangangailangan ng maraming instrumento, ngunit nangangailangan din ng oras at pagsisikap.Ang mga mantsa na ginamit na Ethidium bromide ay nakakapinsala sa katawan ng tao, at ang mga kumplikadong eksperimentong pamamaraan na ito ay nagbibigay ng mga pagkakataon para sa polusyon at mga maling positibo.Gayunpaman, kailangan lang ng FQ-PCR na buksan ang takip nang isang beses habang naglo-load ng sample, at ang kasunod na proseso ay ganap na closed-tube na operasyon, na hindi nangangailangan ng post-processing ng PCR, na iniiwasan ang maraming disbentaha sa conventional PCR operations.Karaniwang ginagamit ng eksperimento ang ABI7100 PCR thermal cycler na binuo ng kumpanya ng PE.
Ang instrumento ay may mga sumusunod na katangian: ① Malawak na aplikasyon: Ito ay magagamit para sa DNA at RNA PCR product quantification, gene expression research, pathogen detection, at optimization ng PCR condition.② Natatanging quantitative na prinsipyo: Gamit ang fluorescently labeled probes, ang dami ng fluorescence ay maiipon kasama ng PCR cycle pagkatapos ng laser excitation, upang makamit ang layunin ng quantification.③ Mataas na kahusayan sa pagtatrabaho: Built-in na 9600 PCR thermal cycler, kinokontrol ng computer ng 1 hanggang 2 oras upang makumpleto ang amplification at quantification ng 96 na sample nang awtomatiko at sabay-sabay.④ Hindi na kailangan para sa gel electrophoresis: Hindi na kailangang palabnawin at electrophoresis ang sample, gumamit lamang ng espesyal na probe upang direktang makita ang reaction tube.⑤Walang polusyon sa pipeline: Ang natatanging fully enclosed reaction tube at photoelectric conduction system ay pinagtibay, kaya hindi na kailangang mag-alala tungkol sa polusyon.⑥Ang mga resulta ay maaaring kopyahin: ang quantitative dynamic na hanay ay hanggang sa limang order ng magnitude.Samakatuwid, dahil ang teknolohiyang ito ay matagumpay na binuo, ito ay pinahahalagahan ng maraming siyentipikong mananaliksik at nailapat sa maraming larangan.
2 Mga prinsipyo at pamamaraan
Ang gumaganang prinsipyo ng FQ-PCR ay ang paggamit ng 5′→3′ exonuclease na aktibidad ng Taq enzyme upang magdagdag ng fluorescently na may label na probe sa PCR reaction system.Ang probe ay maaaring partikular na mag-hybrid sa template ng DNA na nasa primer sequence.Ang 5′end ng probe ay may label na may fluorescence emission gene FAM (6-carboxyfluorescein, fluorescence emission peak sa 518nm), at ang 3′end ay may label na The fluorescence quenching group TAMRA (6-carboxytetramethylrhodamine, fluorescence emission peak sa 582 emission peak sa 582 emission peak sa 582 emission peak) ang probe mula sa pagpapalawig sa panahon ng PCR amplification.Kapag nananatiling buo ang probe, pinipigilan ng pangkat ng quencher ang paglabas ng fluorescence ng naglalabas na grupo.Kapag ang naglalabas na grupo ay nahiwalay mula sa pangkat ng pagsusubo, ang inhibition ay itinataas, at ang optical density sa 518nm ay tumataas at nakita ng fluorescence detection system.Kapag ang probe ay naputol, ang quenching effect ay inilabas at ang fluorescent signal ay inilabas.Sa tuwing makokopya ang template, pinuputol ang isang probe, na sinamahan ng paglabas ng fluorescent signal.Dahil mayroong isa-sa-isang ugnayan sa pagitan ng bilang ng mga inilabas na fluorophores at bilang ng mga produkto ng PCR, magagamit ang diskarteng ito upang tumpak na mabilang ang template.Karaniwang ginagamit ng pang-eksperimentong instrumento ang ABI7100 PCR thermal cycler na binuo ng kumpanya ng PE, at maaari ding gamitin ang iba pang mga thermal cycler.Kung ang sistema ng reaksyon ng uri ng reaksyon ng ABI7700 ay ginagamit para sa eksperimento, pagkatapos makumpleto ang reaksyon, ang mga resulta ng dami ay maaaring direktang ibigay sa pamamagitan ng pagsusuri sa computer.Kung gagamit ka ng iba pang mga thermal cycler, kailangan mong gumamit ng fluorescence detector para sukatin ang fluorescence signal sa reaction tube nang sabay-sabay para kalkulahin ang RQ+, RQ-, △RQ.Ang RQ+ ay kumakatawan sa ratio ng luminescence intensity ng fluorescent emission group ng sample tube sa luminescence intensity ng quenching group, RQ- ay kumakatawan sa ratio ng dalawa sa blangko na tubo, △RQ (△RQ=RQ+-RQ-) ay kumakatawan sa dami ng fluorescence na pagbabago ng signal sa panahon ng PCR Pagkatapos ng pagpoproseso ng data ay maaaring dami.Dahil sa pagpapakilala ng mga fluorescent probe, ang pagtitiyak ng eksperimento ay makabuluhang napabuti.Ang disenyo ng probe sa pangkalahatan ay dapat na matugunan ang mga sumusunod na kondisyon: ①Ang haba ng probe ay dapat na humigit-kumulang 20-40 base upang matiyak ang pagtitiyak ng pagbubuklod.②Ang nilalaman ng mga base ng GC ay nasa pagitan ng 40% at 60% upang maiwasan ang pagdoble ng mga solong pagkakasunud-sunod ng nucleotide.③ Iwasan ang hybridization o overlap sa mga primer.④ Ang stability ng binding sa pagitan ng probe at template ay mas malaki kaysa sa stability ng binding sa pagitan ng primer at template, kaya ang Tm value ng probe ay dapat na hindi bababa sa 5°C na mas mataas kaysa sa Tm value ng primer.Bilang karagdagan, ang konsentrasyon ng probe, ang homology sa pagitan ng probe at ang template sequence, at ang distansya sa pagitan ng probe at ang primer ay lahat ay may epekto sa mga eksperimentong resulta.
Kaugnay na Mga Produkto:
China Real Time PCR Easyᵀᴹ-Taqman Manufacturer at Supplier |Foregene (foreivd.com)
Oras ng post: Okt-15-2021
