Sa mga eksperimento sa qPCR, ang disenyo ng panimulang aklat ay isa ring napakahalagang link.Kung ang mga primer ay angkop o hindi ay malapit na nauugnay sa kung ang kahusayan ng amplification ay umabot sa pamantayan, kung ang mga amplified na produkto ay partikular, at kung ang mga eksperimentong resulta ay magagamit.
Kaya paano gawing mas mahusay ang pagtitiyak ng primer ng qPCR?Mataas na kahusayan sa amplification?
Ngayon, dadalhin ka namin upang magdisenyo ng mga primer ng qPCR nang magkasama, at hahayaan ang disenyo ng primer ng qPCR na maging isang mahusay na kasanayan sa kaalaman sa mga eksperimento.
Kapag nagdidisenyo ng mga primer ng qPCR, karaniwang bigyang-pansin ang mga sumusunod na punto: ang mga primer ay dapat na idinisenyo sa mga intron hangga't maaari, ang haba ng produkto ay dapat na 100-300 bp, ang halaga ng Tm ay dapat na mas malapit hangga't maaari sa 60°C, at ang upstream at downstream na mga primer ay dapat na malapit hangga't maaari, at ang dulo ng primer ay dapat na G o C, atbp. wait.
1. Disenyo ng mga panimulang aklat na sumasaklaw sa mga intron
Kapag nagdidisenyo ng mga primer ng qPCR, ang pagpili ng mga primer na idinisenyo sa mga intron ay maaaring maiwasan ang paglaki ng template ng gDNA, at lahat ng mga produkto ay hinango mula sa amplification ng cDNA, kaya inaalis ang impluwensya ng kontaminasyon ng gDNA.
2. Haba ng panimulang aklat
Ang haba ng primer ay karaniwang nasa pagitan ng 18-30 nt, at ang haba ng produkto ng amplification ay dapat kontrolin sa pagitan ng 100-300 bp hangga't maaari.
Kung ang panimulang aklat ay masyadong maikli, ito ay hahantong sa hindi tiyak na pagpapalakas, at kung ito ay masyadong mahaba, madali itong mabuo ng pangalawang istraktura (tulad ng istraktura ng hairpin).Kung ang produkto ng amplification ay masyadong mahaba, hindi ito angkop para sa reaksyon ng polymerase, na makakaapekto sa kahusayan ng PCR amplification.
3. Nilalaman ng GC at halaga ng Tm
Ang GC na nilalaman ng mga panimulang aklat ay dapat kontrolin sa pagitan ng 40% at 60%.Kung ito ay masyadong mataas o masyadong mababa, ito ay hindi nakakatulong sa pagsisimula ng reaksyon.Ang GC na nilalaman ng pasulong at pabalik na mga primer ay dapat na malapit sa pareho upang makakuha ng parehong halaga ng Tm at temperatura ng pagsusubo.
Ang halaga ng Tm ay dapat nasa pagitan ng 55-65°C hangga't maaari, sa pangkalahatan ay nasa paligid ng 60°C, at ang halaga ng Tm ng upstream at downstream ay dapat na mas malapit hangga't maaari, mas mabuti na hindi hihigit sa 4°C.
4. Iwasang piliin ang A sa 3′ dulo ng primer
Kapag ang 3′ dulo ng panimulang aklat ay hindi tugma, may malaking pagkakaiba sa kahusayan ng synthesis ng iba't ibang base.Kapag ang huling base ay A, maaari rin itong magsimula ng chain synthesis kahit na sa kaso ng mismatching, at kapag ang huling base ay T When , ang kahusayan ng mismatch induction ay lubhang nababawasan.Samakatuwid, subukang iwasan ang pagpili ng A sa 3′ dulo ng panimulang aklat, at mas mabuting piliin ang T.
Kung ito ay isang probe primer, ang 5′ na dulo ng probe ay hindi maaaring G, dahil kahit na ang isang solong G base ay konektado sa FAM fluorescent reporter group, maaari ding pawiin ng G ang fluorescent signal na ibinubuga ng FAM group, na nagreresulta sa mga maling negatibong resulta.Lumitaw.
5. Base pamamahagi
Ang distribusyon ng apat na base sa primer ay mas mainam na random, iniiwasan ang higit sa 3 magkasunod na G o C sa dulong 3′, at higit sa 3 magkasunodAng G o C ay madaling bumuo ng pagpapares sa rehiyon ng sequence na mayaman sa GC.
6. Dapat iwasan ng rehiyon ng panimulang disenyo ang mga kumplikadong pangalawang istruktura.
Ang pangalawang istraktura na nabuo ng solong strand ng produkto ng amplification ay makakaapekto sa maayos na pag-unlad ng PCR.Sa pamamagitan ng paghula kung mayroong pangalawang istraktura sa target na pagkakasunud-sunod nang maaga, subukang iwasan ang rehiyong ito sa disenyo ng mga panimulang aklat.
7. Ang mga panimulang aklat mismo at sa pagitan ng mga panimulang aklat ay dapat subukang iwasan ang magkakasunod na komplementaryong base.
Maaaring walang magkakasunod na 4 na base na complementarity sa pagitan ng primer mismo at ng primer.Ang primer mismo ay hindi dapat magkaroon ng isang pantulong na pagkakasunud-sunod, kung hindi, ito ay tupitik ang sarili upang bumuo ng isang hairpin na istraktura, na makakaapekto sa kumbinasyon ng pagsusubo ng primer at ang template.
Ang mga pantulong na pagkakasunud-sunod ay hindi maaaring umiral sa pagitan ng upstream at downstream na mga primer.Ang complementarity sa pagitan ng mga primer ay magbubunga ng mga primer na dimer, na magbabawas sa kahusayan ng PCR at makakaapekto pa sa quantitative accuracy.Kung hindi maiiwasan ang primer-dimer at hairpin structures, hindi dapat masyadong mataas ang △G value (dapat mas mababa sa 4.5 kcal/mol).
8. Ang mga panimulang aklat ay nagpapalaki sa target na partikular na produkto.
Ang pangwakas na layunin ng pagtuklas ng qPCR ay upang maunawaan ang kasaganaan ng target na gene.Kung mangyari ang hindi partikular na amplification, magiging hindi tumpak ang quantification.Samakatuwid, pagkatapos na idisenyo ang mga panimulang aklat, kailangan nilang masuri ng BLAST, at ang pagtitiyak ng mga produkto ay inihambing sa database ng pagkakasunud-sunod.
Susunod, kinukuha namin ang gene ng GAS6 (Growth arrest specific 6) ng tao bilang isang halimbawa upang magdisenyo ng mga primer ng qPCR.
01 query gene
Homo GAS6sa pamamagitan ng NCBI.Dito, dapat nating bigyang pansin ang paghahambing ng pangalan ng gene at species upang matiyak na pare-pareho ang mga ito.
02 Hanapin ang sequence ng gene
(1) Kung ang target na sequence ay genomic DNA, piliin ang una, na siyang genomic DNA sequence ng gene.
(2) Kung ang target na sequence ay mRNA, piliin ang pangalawa.Pagkatapos ipasok, i-click ang “CDS” sa talahanayan sa ibaba.Ang pagkakasunud-sunod ng brown na background ay ang pagkakasunud-sunod ng coding ng gene.
03 Mga panimulang aklat sa disenyo
Ipasok ang interface ng Primer-BLAST
Ilagay ang gene sequence number o ang sequence sa Fasta format sa kaliwang itaas, at punan ang mga nauugnay na parameter.

I-click ang "Kumuha ng mga panimulang aklat" at lalabas ang NCBI upang sabihin sa iyo na ang naturang pagpili ng parameter ay lalawak sa iba pang mga variant ng splicing.Maaari naming suriin ang iba't ibang mga variant ng splicing at isumite ang mga ito upang makuha ang naaangkop na pares ng primer (tulad ng ipinapakita sa figure sa ibaba).Ang prosesong ito ay maaaring tumagal ng sampu-sampung segundo upang tumakbo.
Ang mga temperatura ng pagsusubo ng mga pares ng primer na ito ay nasa paligid ng 60°C.Ayon sa layunin ng eksperimento, pumili ng mga panimulang aklat na may katamtamang haba, mahusay na pagtitiyak at hindi gaanong pagpupuno sa sarili ng mga panimulang aklat para sa eksperimento, at ang rate ng tagumpay ay medyo mataas!
04Pagpapatunay sa pagtitiyak ng primer
Sa katunayan, bilang karagdagan sa pagdidisenyo ng mga panimulang aklat, maaari ding suriin ng Primer-Blast ang mga primer na idinisenyo namin mismo.Bumalik sa pahina ng disenyo ng panimulang aklat, ilagay ang mga upstream at downstream na primer na aming idinisenyo, at hindi isasaayos ang iba pang mga parameter.Pagkatapos isumite, makikita mo kung ang pares ng mga panimulang aklat ay umiiral din sa ibang mga gene.Kung ang lahat ng mga ito ay ipinapakita sa gene na gusto naming palakihin , na nagpapahiwatig na ang pagtitiyak ng pares ng mga primer na ito ay mahusay!(Halimbawa, ito lang ang resulta ng primer query!)

05 Pangunahing paghuhusga sa kalidad
Anong uri ng panimulang aklat ang "perpektong" primer na pinagsasama ang "episyente ng amplification hanggang sa pamantayan", "pinalakas na mga katangian ng produkto", at "maaasahang mga resulta ng eksperimentong"?
Episyente ng amplification

natutunaw na kurba
Ang kahusayan ng amplification ng mga panimulang aklat ay umabot sa 90% -110%, na nangangahulugan na ang kahusayan ng amplification ay mabuti, at ang curve ng pagtunaw ay may isang solong rurok at kadalasang Tm>80°C, na nangangahulugan na ang pagtitiyak ng amplification ay mabuti.
 
Kaugnay na Mga Produkto:
Real Time PCR Easy–SYBR GREEN I
Real Time PCR Easy-Taqman