Ang Real Time PCR, na kilala rin bilang quantitative PCR o qPCR, ay isang paraan para sa real-time na pagsubaybay at pagsusuri ng mga produkto ng PCR amplification.
Dahil ang quantitative PCR ay may mga pakinabang ng simpleng operasyon, mabilis at maginhawa, mataas na sensitivity, mahusay na repeatability, at mababang rate ng kontaminasyon, malawak itong ginagamit sa pagsusuring medikal, pagtatasa ng pagiging epektibo ng gamot, pananaliksik sa expression ng gene, pananaliksik sa transgenic, pagtuklas ng gene, pagtuklas ng pathogen, pagtuklas ng hayop at halaman., pagsubok sa pagkain at iba pang larangan.
Samakatuwid, kung ikaw ay nakikibahagi sa mga pangunahing pananaliksik sa mga agham ng buhay, o mga empleyado ng mga kumpanya ng parmasyutiko, mga kumpanya ng pag-aalaga ng hayop, mga kumpanya ng pagkain, o kahit na mga empleyado ng entry-exit inspection at quarantine bureaus, mga departamento ng pagsubaybay sa kapaligiran, mga ospital at iba pang mga yunit, ikaw ay mas mababa o mas malalantad sa O kailangan mong malaman ang kaalaman sa pag-master ng quantitative PCR.

Prinsipyo ng Real Time PCR

Ang Real Time PCR ay isang paraan kung saan ang mga fluorescent substance ay idinagdag sa PCR reaction system, at ang fluorescence signal intensity sa proseso ng PCR reaction ay sinusubaybayan sa real time ng isang quantitative PCR instrument, at sa wakas ang eksperimentong data ay sinusuri at pinoproseso.

【Curve ng amplification】ay ang kurba na naglalarawan sa pabago-bagong proseso ng PCR.Ang amplification curve ng PCR ay hindi talaga isang standard exponential curve, ngunit isang sigmoid curve.

[Platform phase ng amplification curve]Sa pagtaas ng bilang ng mga cycle ng PCR, ang hindi aktibo ng DNA polymerase, ang pag-ubos ng mga dNTP at primer, at ang pagsugpo ng reaksyon ng synthesis ng reaksyon ng by-product pyrophosphate, atbp., ang PCR ay hindi palaging lumalawak nang exponentially., at sa kalaunan ay papasok sa isang talampas.

[Exponential Growth Rehiyon ng Amplification Curve]Kahit na ang yugto ng talampas ay malaki ang pagkakaiba-iba, sa isang tiyak na rehiyon ng exponential growth region ng amplification curve, ang repeatability ay napakahusay, na napakahalaga para sa quantitative analysis ng PCR.

[Halaga ng threshold at halaga ng Ct]Itinakda namin ang limitasyon ng halaga ng pag-detect ng fluorescence sa naaangkop na posisyon sa exponential growth area ng amplification curve, katulad ng threshold value (Threshold).Ang intersection ng threshold value at amplification curve ay ang Ct value, ibig sabihin, ang Ct value ay tumutukoy sa bilang ng mga cycle (Threshold Cycle) kapag naabot ang threshold value.

Ang graph sa ibaba ay malinaw na nagpapakita ng kaugnayan sa pagitan ng threshold line at amplification curve, threshold at Ct value.

【Paano mag quantify?】

Napatunayan ng teoryang matematika na ang halaga ng Ct ay may kabaligtaran na linear na relasyon sa logarithm ng bilang ng mga paunang template.Sinusubaybayan ng Real Time PCR ang mga produkto ng PCR amplification sa real time at binibilang ang mga ito sa panahon ng exponential amplification phase.

Para sa bawat cycle ng PCR, ang DNA ay tumaas nang 2 beses, at sa lalong madaling panahon ay umabot sa isang talampas.

Ipagpalagay na ang halaga ng panimulang DNA ay A₀ , pagkatapos ng n cycle, ang teoretikal na halaga ng produkto ng DNA ay maaaring ipahayag bilang:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

Pagkatapos, mas marami ang paunang halaga ng DNA na A 0, mas maagang maabot ng halaga ng pinalakas na produkto ang halaga ng pagtuklas na An , at ang bilang ng mga cycle kapag umabot sa An ay ang halaga ng Ct.Iyon ay, kung mas ang paunang halaga ng DNA na A 0 ay, mas maaga ang paglaki ng kurba ng amplification, at ang katumbas na kinakailangang bilang ng mga cycle n ay mas maliit.

Nagsasagawa kami ng gradient dilution ng pamantayan ng kilalang konsentrasyon at ginagamit ito bilang isang template para sa Real Time PCR, at isang serye ng mga amplification curves ang makukuha sa pantay na pagitan sa pagkakasunud-sunod ng pagsisimula ng dami ng DNA mula sa higit pa hanggang sa mas kaunti.Ayon sa linear na relasyon sa pagitan ng halaga ng Ct at ang logarithm ng bilang ng mga panimulang template, a[standard curve] ay maaaring malikha .

Sa pamamagitan ng pagpapalit ng Ct value ng sample na may hindi kilalang konsentrasyon sa karaniwang curve, ang paunang halaga ng template ng sample na may hindi kilalang konsentrasyon ay maaaring makuha, na siyang quantitative na prinsipyo ng Real Time PCR.

Paraan ng pagtuklas ng Real Time PCR

Nakikita ng Real Time PCR ang mga produkto ng PCR amplification sa pamamagitan ng pag-detect ng fluorescence intensity sa reaction system.

Prinsipyo ng Fluorescent Dye Embedding Method】

Mga tina ng fluorescent, tulad ng TB Green ® , ay maaaring hindi partikular na magbigkis sa double-stranded na DNA sa mga PCR system at mag-fluoresce kapag nag-binding.

Ang intensity ng fluorescence sa sistema ng reaksyon ay tumaas nang husto sa pagtaas ng mga cycle ng PCR.Sa pamamagitan ng pag-detect ng fluorescence intensity, ang dami ng DNA amplification sa reaction system ay maaaring masubaybayan sa real time, at pagkatapos ay ang halaga ng panimulang template sa sample ay maaaring reversely estimate.

【Prinsipyo ng fluorescent probe method】

fluorescent probeay isang nucleic acid sequence na may fluorescent group sa 5′ end at isang quenching group sa 3′ end, na maaaring partikular na magbigkis sa template.Kapag ang probe ay buo, ang fluorescence na ibinubuga ng fluorophore ay pinapatay ng pangkat ng pagsusubo at hindi maaaring mag-fluoresce.Kapag ang probe ay nabulok, ang fluorescent substance ay maghihiwalay at maglalabas ng fluorescence.

Ang isang fluorescent probe ay idinagdag sa PCR reaction solution.Sa panahon ng proseso ng pagsusubo, ang fluorescent probe ay magbibigkis sa partikular na posisyon ng template.Sa panahon ng proseso ng extension, ang 5′→3′ exonuclease na aktibidad ng PCR enzyme ay maaaring mabulok ang fluorescent probe na na-hybrid sa template, at ang fluorescent substance ay dissociated upang maglabas ng fluorescence.Sa pamamagitan ng pag-detect ng fluorescence intensity ng probe sa reaction system, ang layunin ng pagsubaybay sa amplification amount ng PCR product ay maaaring makamit.

【Pagpili ng Fluorescence Detection Method】

Kung ito ay ginagamit upang makilala ang mga pagkakasunud-sunod na may mataas na homology at magsagawa ng multiplex PCR detection tulad ng SNP typing analysis, ang fluorescent probe method ay hindi mapapalitan.
Para sa iba pang mga eksperimento sa Real Time PCR, maaaring gumamit ng simple, madali at murang fluorescent chimera method.

probesMalakas na pagtitiyak, kaya ng multiplex PCR

Pagkukulang

Mga kinakailangan sa mataas na pagtitiyak para sa amplification;

hindi maisagawa ang multiplex PCRKailangan na magdisenyo ng mga tiyak na probes, mataas ang gastos;

minsan mahirap ang disenyo ng probe

Kaugnay na Mga Produkto: