Pagtitiyak ng pagtuklas
Sa karamihan ng mga kaso, ang layunin ng disenyo ng panimulang aklat ay upang i-maximize ang pagiging tiyak ng PCR.Ito ay tinutukoy ng higit pa o hindi gaanong mahuhulaan na impluwensya ng maraming mga variable.Ang isang mahalagang variable ay ang sequence sa 3′end ng primer.
Mahalaga, ang mga PCR assay na idinisenyo para sa pagtitiyak ay mas malamang na mapanatili ang mataas na kahusayan sa isang malawak na dynamic na hanay, dahil ang assay ay hindi gumagawa ng mga di-tiyak na mga produkto ng amplification, sa gayon ay nakikipagkumpitensya sa mga PCR reagents o inhibiting ang pangunahing reaksyon ng amplification.
Siyempre, sa ilang mga kaso, ang pagtitiyak ay hindi ang pinakamahalaga, halimbawa, kapag ang layunin ay upang mabilang ang malapit na nauugnay ngunit iba't ibang mga pathogen, espesyal na disenyo, pag-optimize at mga pamantayan sa pag-verify ay kinakailangan.
Ang melting curve ay isang karaniwang paraan para sa pagtatasa ng pagiging tiyak ng mga amplicon, kahit man lang sa mga tuntunin ng kung palakasin ang isang target.Gayunpaman, dapat itong bigyang-diin na ang mga melting curve ay maaaring mapanlinlang dahil, halimbawa, maaari silang maapektuhan ng pinagsamang epekto ng mga suboptimal na primer at mababang konsentrasyon ng template.
P5 |Ipinapakita ng melting curve ang mga Tm shift na nakuha mula sa dalawang pagtuklas ng magkaibang halaga ng dalawang target na DNA.
A. Sa mas mataas na konsentrasyon (ad)), walang malinaw na primer dimer pagkatapos makumpleto ang pagsukat ng qPCR.Habang bumababa ang konsentrasyon ng template sa 50 kopya (e), nagsisimulang lumitaw ang isang hindi partikular na produkto at naging tanging produkto sa pinakamababang konsentrasyon (f).
B. Ang pagsubok ay naitala ang parehong Tms sa lahat ng target na konsentrasyon, at walang halatang primer dimer kahit na sa pinakamababang konsentrasyon (5 kopya).Kapag ginagamit ang dalawang paraan ng pagtuklas na ito, walang nakitang produkto ng amplification sa mga NTC.
Ipinapakita ng P5 ang mga curve ng dissolution na nakuha gamit ang mga sample kung saan ang template ay naroroon sa iba't ibang konsentrasyon.Ipinapakita ng P 5a na sa dalawang pinakamababang konsentrasyon, ang Tms ng mga hindi partikular na produkto ng amplification na ginawa ay mas mababa kaysa sa mga partikular na amplicon.
Malinaw, ang paraan ng pagtuklas na ito ay hindi maaasahang magamit upang makita ang mga target na umiiral sa mababang konsentrasyon.
Kapansin-pansin, ang mga NTC, ibig sabihin, mga sample na walang DNA, ay hindi nagtala ng (hindi partikular) na mga produkto ng amplification, na nagpapahiwatig na ang background genomic DNA ay maaaring lumahok sa hindi partikular na amplification/polymerization.
Kung minsan ang mga background na primer at hindi partikular na amplification ay hindi maaayos, ngunit kadalasan ay posible na magdisenyo ng isang paraan ng pagtuklas na walang hindi partikular na amplification sa anumang konsentrasyon ng template at NTC (P 5b).
Dito, kahit na ang pag-record ng amplification ng target na konsentrasyon na may Cq na 35 ay magbubunga ng isang tiyak na curve ng dissolution.Katulad nito, ang mga NTC ay hindi nagpakita ng mga palatandaan ng hindi tiyak na pagpapalakas.Minsan, ang pag-uugali ng pagtuklas ay maaaring nakadepende sa ina na alak, at tanging ang di-tiyak na amplification lamang ang nakita sa ilang mga komposisyon ng buffer, na maaaring nauugnay sa iba't ibang mga konsentrasyon ng Mg2+.
Katatagan ng pagtuklas
Ang pag-optimize ng Ta ay isang kapaki-pakinabang na hakbang sa empirical na pag-verify at proseso ng pag-optimize ng qPCR detection.Nagbibigay ito ng direktang indikasyon ng tibay ng panimulang itinakda sa pamamagitan ng pagpapakita ng temperatura (o hanay ng temperatura) na gumagawa ng pinakamababang Cq nang hindi pinapalaki ang NTC.
Ang dalawa hanggang apat na beses na pagkakaiba sa sensitivity ay maaaring hindi mahalaga para sa mga taong may mataas na mRNA expression, ngunit para sa mga diagnostic na pagsusuri, ito ay maaaring mangahulugan ng pagkakaiba sa pagitan ng positibo at maling negatibong mga resulta.
Ang mga katangian ng Ta ng mga primer ng qPCR ay maaaring mag-iba nang malaki.Ang ilang mga pagsubok ay hindi masyadong matatag, at kung hindi sila isasagawa sa ilalim ng pinakamainam na halaga ng Ta ng mga panimulang aklat, mabilis silang babagsak.
Ito ay mahalaga dahil ang ganitong uri ng pagtuklas ay kadalasang may problema sa totoong mundo, at ang kadalisayan ng sample, ang konsentrasyon ng DNA, o ang pagkakaroon ng ibang DNA ay maaaring hindi pinakamainam.
Bilang karagdagan, ang target na numero ng kopya ay maaaring mag-iba sa isang malawak na hanay, at ang mga reagents, plastic na kagamitan, o mga instrumento ay maaaring iba sa mga ginamit kapag nagse-set up ng pagsubok.
P6|Ang temperatura gradient ay nagpapakita ng iba't ibang tibay ng PCR detection.
A. Gamitin ang Sensifast SYBR mastermix ng Bioline (catalog number BIO-98050) para magsagawa ng PCR sa cDNA na inihanda mula sa RNA ng utak ng tao.
B. Gamitin ang instrumento ng CFX qPCR ng Bio-Rad para i-record ang amplification map at dissolution curve ng apalene (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGGTGATCTCCTAGG).
C. Amplification graph at melting curve ng ACSBG1 (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG).
D. Amplification graph at dissolution curve ng GFAP (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCCTCGTGGATCTTC).
E. Cqs na naitala sa iba't ibang temperatura ng pagsusubo, na nagpapakita ng pagkakaiba sa Cq na naitala sa ilalim ng 7C temperature gradient.
Ang P 6 ay nagpapakita ng isang tipikal na resulta ng isang hindi kanais-nais na pagsubok, kung saan isinagawa ang qPCR gamit ang isang gradient Tas sa pagitan ng 59C at 67C (P 6a), gamit ang mga panimulang aklat para sa tatlong mga gene na partikular sa utak ng tao.
Makikita mula sa amplification graph na ang mga panimulang aklat ng Opalin ay malayo sa perpekto dahil ang kanilang pinakamainam na hanay ng Ta ay napakakitid (Larawan 6b), iyon ay, ang mga Cq ay malawak na nakakalat, na nagreresulta sa Cqs na makabuluhang inihambing sa kanilang pinakamainam na Cqs Low.
Ang paraan ng pagtuklas na ito ay hindi matatag at maaaring humantong sa suboptimal na amplification.Samakatuwid, ang pares ng panimulang aklat na ito ay dapat na muling idisenyo.Bilang karagdagan, ang pagsusuri ng melting curve (inset) ay nagpapakita na ang pagtitiyak ng paraan ng pagtuklas na ito ay maaari ding maging problema, dahil ang melting curve ng bawat Ta ay iba.
Ang paraan ng pagtuklas ng ACSBG1 na ipinapakita sa P 6c ay mas matatag kaysa sa paraan ng pagtuklas ng Opalin sa itaas, ngunit malayo pa rin ito sa perpekto, at malamang na maaari itong mapabuti.
Gayunpaman, binibigyang-diin namin na walang kinakailangang koneksyon sa pagitan ng katatagan at pagtitiyak, dahil ang curve ng dissolution na ginawa ng paraan ng pagtuklas na ito ay nagpapakita ng parehong peak value sa lahat ng Tas (inset).
Sa kabilang banda, ang pagsubok sa katatagan ay mas mapagparaya, na gumagawa ng mga katulad na Cq sa isang malawak na hanay ng Tas, tulad ng sa pagsubok sa GFAP na ipinakita sa P 6d.
Ang pagkakaiba sa mga Cq na nakuha sa parehong 8 degrees Celsius na hanay ay mas mababa sa 1, at ang dissolution curve (inset) ay nagpapatunay sa mga katangian ng pagtuklas sa hanay ng temperatura na ito.Kapansin-pansin na ang kinakalkulang Tas at ang aktwal na hanay ng Ta ay maaaring ibang-iba.
Maraming mga alituntunin na idinisenyo upang tulungan ang mga mananaliksik na magdisenyo ng mahusay na mga panimulang aklat, karamihan sa mga ito ay nakabatay sa matagal nang itinatag na mga panuntunan at maraming atensyon ang ibinibigay sa 3′end ng mga panimulang aklat.Kadalasang inirerekomendang magsama ng G o C sa 3' dulo at dalawang G o C base (GC clamp), ngunit hindi hihigit sa dalawa sa huling 5 base.
Sa pagsasagawa, ang mga panuntunang ito ay maaaring gumabay sa mga mananaliksik, ngunit hindi naman sila tama sa lahat ng pagkakataon.
P7 |Ang 3′end ng panimulang aklat ay may maliit na epekto sa pagiging tiyak o kahusayan.
A. Ang posisyon ng mga panimulang aklat para sa gene ng HIF-1α (NM_181054.2) ng tao.
B. Gumamit ng Agilent Brilliant III SYBR Green mother liquor (Cat. No. 600882) para palakihin ang anim na test items.
C. Amplification graph at melting curve na naitala ng Bio-Rad's CFX qPCR instrument at 3′end primers.Ang mga NTC ay ipinapakita sa pula.
D. Cqs record ng bawat test item
Halimbawa, ang resulta sa P 7 ay sumasalungat sa 3′end na tuntunin.Ang lahat ng mga disenyo ay gumagawa ng halos parehong mga resulta, na may dalawang primer na kumbinasyon lamang na humahantong sa hindi partikular na amplification sa NTC.
Gayunpaman, hindi namin maaaring suportahan ang epekto ng GC clip, dahil sa kasong ito, ang paggamit ng A o T bilang maximum na 30 base ay hindi nakakabawas sa pagiging tiyak.
Ang Test C, kung saan nagtatapos ang F primer sa GGCC, ay nagtala ng mga Cq sa mga NTC, na nagsasaad na maaaring gusto ng isa na iwasan ang mga pagkakasunud-sunod na ito sa 30-end.Binibigyang-diin namin na ang tanging paraan upang matukoy ang pinakamahusay na 3′end na pagkakasunud-sunod ng isang pares ng panimulang aklat ay ang pagsusuri ng ilang primer ng kandidato sa eksperimento.
Episyente ng amplification
Ang mahalaga, bagama't hindi kailanman maaaring maging tiyak ang non-specific na PCR detection, maaaring maisaayos at ma-maximize ang kahusayan ng amplification sa maraming iba't ibang paraan sa pamamagitan ng pagbabago ng enzyme, mother liquor, additives, at mga kondisyon ng pagbibisikleta.
Upang suriin ang kahusayan ng pagtuklas ng PCR, pinakamahusay na gumamit ng isang serial dilution na 10 o 5 beses ang target na nucleic acid, iyon ay, ang "standard na paraan ng curve".
Kung ang mga PCR amplicon o sintetikong DNA target ay ginagamit upang makabuo ng isang karaniwang curve, ang mga serial dilution ng mga target na ito ay dapat ihalo sa isang pare-parehong dami ng background DNA (tulad ng genomic DNA).
P8 |Dilution curve upang suriin ang kahusayan ng PCR.
A. Gumamit ng mga panimulang aklat para sa HIF-1: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA at R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC at Agilent's Brilliant III SYBR Green mastermix (catalog number 600882) para sa PCR at mga kondisyon ng melting curve.
B. Ang 100 ng RNA ay na-reverse transcribe, natunaw ng 2 beses, at ang mga serially diluted na cDNA sample ay natunaw ng 5 beses hanggang 1 ng human genomic DNA.Ang melting curve ay ipinapakita sa inset.
C. Ang reaksyon ng RT, pagbabanto, at serial dilution ay inulit para sa pangalawang sample ng cDNA, at ang mga resulta ay magkatulad.
Ang P 8 ay nagpapakita ng dalawang karaniwang curves, gamit ang parehong paraan ng pagtuklas sa dalawang magkaibang mga sample ng cDNA, ang resulta ay ang parehong kahusayan, tungkol sa 100%, at ang halaga ng R2 ay magkatulad din, iyon ay, ang antas ng akma sa pagitan ng pang-eksperimentong data at ang regression line o ang data Degree of linearity.
Ang dalawang karaniwang kurba ay maihahambing, ngunit hindi eksaktong pareho.Kung ang layunin ay tumpak na mabilang ang target, dapat tandaan na hindi katanggap-tanggap na magbigay ng pagkalkula ng numero ng kopya nang hindi ipinapaliwanag ang kawalan ng katiyakan.
P9 |Kawalang-katiyakan sa pagsukat na nauugnay sa quantification gamit ang isang karaniwang curve.
A. Gumamit ng mga panimulang aklat para sa GAPDH (NM_002046) upang maisagawa ang PCR at mga kondisyon ng melting curve.F: ACAGTTGCCATGTAGACC at R: TAACTGGTTGAGCACAGG at mastermix ng Sensifast SYBR ng Bioline (catalog number BIO-98050).
B. Amplification chart, melting curve at standard curve na naitala gamit ang CFX qPCR instrument ng Bio-Rad.
C. Standard curve graph at 95% confidence interval (CI).
D. Ang numero ng kopya at 95% agwat ng kumpiyansa ng tatlong halaga ng Cq na nagmula sa curve ng dilution.
Ipinapakita ng P 9 na para sa isang na-optimize na pagsubok, ang likas na pagkakaiba-iba ng isang standard na curve ay humigit-kumulang 2 beses (95% confidence interval, minimum hanggang maximum), na maaaring ang pinakamaliit na variability na maaaring asahan.
Kaugnay na produkto:
Oras ng post: Set-30-2021
