Batayan sa panimulang disenyo (99% ang mga problema ay malulutas)
1. Haba ng panimulang aklat: Ang aklat-aralin ay nangangailangan ng 15-30bp, karaniwang mga 20bp.Ang aktwal na kondisyon ay mas mahusay na maging 18-24bp upang matiyak ang pagtitiyak, ngunit mas mahaba ang mas mahusay, masyadong mahaba ang panimulang aklat ay mababawasan din ang pagtitiyak, at bawasan ang ani.
2. Primer amplification span: Ang 200-500bp ay angkop, at ang fragment ay maaaring palawakin sa 10kb sa ilalim ng mga partikular na kundisyon.
3. Primer base: Ang nilalaman ng G+C ay dapat na 40-60%, masyadong maliit na G+C amplification effect ay hindi maganda, masyadong maraming G+C ay madaling lumitaw na hindi partikular na mga banda.Ang ATGC ay pinakamahusay na ibinahagi nang random, iniiwasan ang mga kumpol ng higit sa 5 purine o pyrimidine nucleotides.Multi-gc para sa 5′ end at intermediate sequence para mapataas ang stability, iwasan ang rich GC sa 3′ end, walang GC para sa huling 3 base, o walang GC para sa 3 sa huling 5 base.
4. Iwasan ang pangalawang istraktura sa mga panimulang aklat, at iwasan ang komplementasyon sa pagitan ng dalawang panimulang aklat, lalo na ang komplementasyon sa dulo ng 3 ', kung hindi ay mabubuo ang primer dimer at mabubuo ang mga di-tiyak na amplified band.
5. Ang mga base sa 3 'end of primers, lalo na ang huli at penultimate base, ay dapat na mahigpit na ipares upang maiwasan ang PCR failure dahil sa unpaired terminal bases.
6. Ang mga panimulang aklat ay mayroon o maaaring idagdag na may naaangkop na mga cleavage site, at ang amplified na target na sequence ay dapat na may naaangkop na mga cleavage site, na lubhang kapaki-pakinabang para sa cleavage analysis o molecular cloning.
7. Pagtitiyak ng mga panimulang aklat: ang mga panimulang aklat ay dapat na walang halatang homology sa iba pang mga pagkakasunud-sunod sa database ng pagkakasunud-sunod ng nucleic acid.
8. Matutong gumamit ng software: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (Ang online na disenyong ito ay pinakamahusay na gumagana).
Ang nilalaman sa itaas ay maaaring malutas ang hindi bababa sa 99% ng mga problema sa panimulang disenyo.
Kontrolin ang mga detalye ng disenyo ng panimulang aklat
1. Haba ng panimulang aklat
Pangkalahatang haba ng primer ay 18~30 base.Sa pangkalahatan, ang pinakamahalagang kadahilanan na tumutukoy sa temperatura ng pagsusubo ng panimulang aklat ay ang haba ng panimulang aklat.Ang annealing temperature ng primer ay karaniwang pinipili (Tm value -5℃), at ang ilan ay direktang gumagamit ng Tm value.Maaaring gamitin ang mga sumusunod na formula upang halos kalkulahin ang temperatura ng pagsusubo ng mga panimulang aklat.
Kapag ang haba ng primer ay mas mababa sa 20bp: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃
Kapag ang haba ng primer ay higit sa 20bp: 62.3℃+0.41℃(%GC)-500/length-5℃
Bilang karagdagan, maraming software ang maaari ding gamitin upang kalkulahin ang temperatura ng pagsusubo, ang prinsipyo ng pagkalkula ay magkakaiba, kaya kung minsan ang kinakalkula na halaga ay maaaring may maliit na agwat.Upang ma-optimize ang mga reaksyon ng PCR, ang pinakamaikling primer na nagtitiyak ng mga temperatura ng pagsusubo na hindi bababa sa 54 ℃ ay ginagamit para sa pinakamahusay na kahusayan at pagtitiyak.
Sa pangkalahatan, ang pagtitiyak ng panimulang aklat ay tumataas ng apat na salik para sa bawat karagdagang nucleotide, upang ang pinakamababang haba ng primer para sa karamihan ng mga aplikasyon ay 18 nucleotide.Ang itaas na limitasyon ng haba ng panimulang aklat ay hindi napakahalaga, pangunahin na nauugnay sa kahusayan ng reaksyon.Dahil sa entropy, mas mahaba ang panimulang aklat, mas mababa ang rate ng pag-anne nito upang magbigkis sa target na DNA upang bumuo ng isang stable na double-stranded na template para sa DNA polymerase na magbigkis.
Kapag gumagamit ng software upang magdisenyo ng mga panimulang aklat, ang haba ng mga panimulang aklat ay maaaring matukoy sa pamamagitan ng halaga ng TM, lalo na para sa mga panimulang aklat ng fluorescence quantitative PCR, TM=60℃ o higit pa ay dapat na kontrolin.
2.GC na nilalaman
Sa pangkalahatan, ang nilalaman ng G+C sa mga primer na pagkakasunud-sunod ay 40%~60%, at ang nilalaman ng GC at halaga ng Tm ng isang pares ng mga panimulang aklat ay dapat na iugnay.Kung ang panimulang aklat ay may malubhang GC o AT tendency, ang naaangkop na halaga ng A, T o G at C na buntot ay maaaring idagdag sa 5 'end ng primer.
3. Temperatura ng pagsusubo
Ang temperatura ng pagsusubo ay dapat na 5 ℃ na mas mababa kaysa sa temperatura ng unchain.Kung ang bilang ng mga base ng panimulang aklat ay maliit, ang temperatura ng pagsusubo ay maaaring tumaas nang naaangkop, na maaaring mapataas ang pagtitiyak ng PCR.Kung ang bilang ng mga base ay malaki, ang temperatura ng pagsusubo ay maaaring mabawasan nang naaangkop.Ang pagkakaiba ng temperatura ng pagsusubo sa pagitan ng isang pares ng mga panimulang aklat na 4 ℃ ~ 6 ℃ ay hindi makakaapekto sa ani ng PCR, ngunit ang perpektong temperatura ng pagsusubo ng isang pares ng mga primer ay pareho, na maaaring mag-iba sa pagitan ng 55 ℃ ~ 75 ℃.
4. Iwasan ang pangalawang bahagi ng istraktura ng template ng amplification
Pinakamainam na iwasan ang rehiyon ng pangalawang istraktura ng template kapag pinipili ang pinalakas na fragment.Ang matatag na pangalawang istraktura ng target na fragment ay maaaring mahulaan at matantya ng nauugnay na software ng computer, na nakakatulong para sa pagpili ng template.Ipinapakita ng mga eksperimental na resulta na ang pagpapalawak ay madalas na hindi matagumpay kapag ang libreng enerhiya (△G) ng rehiyong papalawakin ay mas mababa sa 58.6lkJ/mol.
5. Hindi tugma sa target na DNA
Kapag ang amplified na target na DNA sequence ay malaki, ang isang panimulang aklat ay maaaring magbigkis sa maraming bahagi ng target na DNA, na magreresulta sa maraming mga banda na lumilitaw sa resulta.Sa pagkakataong ito kinakailangan na gamitin ang BLAST software testing, website:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.Piliin ang I-align ang dalawang sequence (bl2seq).
Ang pag-paste ng mga primer sequence sa zone 1 at pag-target ng mga sequence ng DNA sa zone 2 ay maaaring palitan, at kinakalkula ng BLAST ang complementary, antisense, at iba pang mga posibilidad, kaya hindi kailangang mapansin ng mga user kung ang parehong chain ay sense chain.Maaari mo ring ilagay ang GI number kung alam mo ang GI number ng sequence sa database, kaya hindi mo na kailangang mag-paste ng malaking section ng sequence.Panghuli, i-click ang Align sa 3 upang makita kung ang primer ay may maraming homologous na site sa target na DNA.
6. Primer terminal
Ang 3 'end ng panimulang aklat ay kung saan nagsisimula ang extension, kaya mahalagang maiwasan ang mga hindi pagkakatugma na magsimula doon.Ang 3 'end ay hindi dapat hihigit sa 3 magkasunod na G o C, dahil magiging sanhi ito ng maling pag-trigger ng primer sa rehiyon ng sequence ng pagpapayaman ng G+C.Ang 3 'end ay hindi maaaring bumuo ng anumang pangalawang istraktura, maliban sa mga espesyal na reaksyon ng PCR (AS-PCR), ang 3′ na dulo ng primer ay hindi maaaring magkatugma.Halimbawa, kung ang rehiyon ng pag-encode ay pinalaki, ang 3 'end ng primer ay hindi dapat wakasan sa ikatlong posisyon ng codon, dahil ang ikatlong posisyon ng codon ay madaling masira, na makakaapekto sa pagtitiyak at kahusayan ng amplification.Kapag gumagamit ng annexation primers, sumangguni sa codon use table, bigyang-pansin ang biological preference, huwag gumamit ng annexation primers sa dulong 3′, at gumamit ng mas mataas na konsentrasyon ng primers (1uM-3uM).
7. Pangalawang istraktura ng mga panimulang aklat
Ang mga panimulang aklat mismo ay hindi dapat magkaroon ng mga pantulong na pagkakasunud-sunod, kung hindi, ang mga panimulang aklat mismo ay tiklop sa mga istruktura ng hairpin, at ang pangalawang istrukturang ito ay makakaapekto sa pagbubuklod ng mga panimulang aklat at mga template dahil sa steric na hadlang.Kung ginamit ang artipisyal na paghuhusga, ang tuluy-tuloy na komplementaryong base ng mga panimulang aklat mismo ay hindi dapat hihigit sa 3bp.Dapat ay walang complementarity sa pagitan ng dalawang primer, lalo na ang komplementaryong overlap ng 3 'end ay dapat iwasan upang maiwasan ang pagbuo ng mga primer dimer.Sa pangkalahatan, dapat ay hindi hihigit sa 4 na magkakasunod na base homology o complementarity sa pagitan ng isang pares ng mga panimulang aklat.
8. Magdagdag ng mga marker o loci
Ang 5 'end ay may maliit na epekto sa pagtitiyak ng amplification at samakatuwid ay maaaring mabago nang hindi naaapektuhan ang pagtitiyak ng amplification.Kasama sa pagbabago ng panimulang aklat 5 'end: pagdaragdag ng enzyme restriction site;May label na biotin, fluorescence, digoxin, Eu3+, atbp. Ipakilala ang mga sequence ng DNA na nagbubuklod ng protina;Ipinapakilala ang mga site ng mutation, pagpasok at nawawalang mga sequence ng mutation at pagpapakilala ng mga sequence ng promoter, atbp. Ang mga dagdag na base ay higit o mas makakaapekto sa kahusayan ng amplification at magpapataas ng pagkakataon ng pagbuo ng primer dimer, ngunit ang ilang mga konsesyon ay dapat gawin para sa susunod na hakbang.Ang mga karagdagang sequence na wala sa target na sequence, tulad ng mga restriction site at promoter sequence, ay maaaring idagdag sa 5′ end ng primer nang hindi naaapektuhan ang specificity.Ang mga sequence na ito ay hindi kasama sa pagkalkula ng mga panimulang halaga ng Tm, ngunit dapat na masuri para sa complementarity at panloob na pangalawang istraktura.
9. Mga subclone
Kadalasan, ang PCR ay paunang pag-clone lamang, at pagkatapos ay kailangan nating i-subclone ang target na fragment sa iba't ibang mga vector, kaya kailangan nating magdisenyo ng mga karagdagang base para sa susunod na operasyon sa hakbang ng PCR.
Ang ilang mga sequence na idinisenyo para sa subcloning ay ibinubuod sa ibaba.
Ang restriction endonuclease restriction site ay idinagdag
Ang pagdaragdag ng mga site ng paghihigpit ng enzyme ay ang pinakakaraniwang ginagamit na paraan para sa pag-subclone ng mga produkto ng PCR.Sa pangkalahatan, ang cleavage site ay anim na base, bilang karagdagan sa 5 'end ng cleavage site ay kailangang magdagdag ng 2 ~ 3 protective base.Gayunpaman, ang bilang ng mga proteksiyon na base na kinakailangan ng iba't ibang mga enzyme ay iba.Halimbawa, ang SalⅠ ay hindi nangangailangan ng protective base, ang EcoRⅤ ay nangangailangan ng 1 protective base, HindiⅠ ay nangangailangan ng 2 protective base, at Hind Ⅲ ay nangangailangan ng 3 protective base.
Idinagdag ng LIC ang buntot
Ang buong pangalan ng LIC ay Ligation-Independent cloning, isang cloning method na naimbento ng Navogen partikular para sa bahagi nito ng pET vector.Ang pET carrier na inihanda ng LIC method ay may non-complementary 12-15 base single strand sticky ends, na umakma sa kaukulang sticky ends sa target insert fragment.Para sa mga layunin ng amplification, ang primer 5′ sequence ng ipinasok na fragment ay dapat umakma sa LIC vector.Ang 3′→5′ extranect na aktibidad ng T4 DNA polymerase ay maaaring bumuo ng isang solong strand na malagkit na dulo sa ipinasok na fragment pagkatapos ng maikling panahon.Dahil ang produkto ay maaari lamang mabuo mula sa mutual annealing ng inihandang insert fragment at ang vector, ang pamamaraang ito ay napakabilis at mahusay, at ito ay nakadirekta sa pag-clone.
Itinuro ang TA clone magdagdag ng buntot
Hindi nagawang i-target ng TA cloning ang fragment sa isang vector, kaya kalaunan ay ipinakilala ng Invitrogen ang isang vector na maaaring mag-target ng cloning, na naglalaman ng apat na kilalang base GTGGS sa isang dulo.Samakatuwid, sa disenyo ng mga primer ng PCR, ang mga pantulong na pagkakasunud-sunod ay dapat idagdag nang naaayon, upang ang mga fragment ay maaaring "oriented".
Kung kulang ka sa oras, maaari mong subukan ang direktang synthesis, pagsasama-sama ng gene sa vector, na tinatawag naming ET gene synthesis sa mga musecularist.
D. In-Fusion cloning method
Walang kinakailangang ligase, hindi nangangailangan ng mahabang reaksyon.Hangga't ang isang pagkakasunud-sunod sa magkabilang dulo ng linearized vector ay ipinakilala Sa disenyo ng mga panimulang aklat, pagkatapos ay ang produkto ng PCR at ang linearized na vector ay idinagdag sa in-fusion enzyme solution na naglalaman ng BSA at inilagay sa temperatura ng silid sa loob ng kalahating oras, ang pagbabago ay maaaring maisagawa.Ang pamamaraang ito ay partikular na angkop para sa malaking dami ng conversion.
10. Pagsamahin ang panimulang aklat
Minsan, limitado lang ang impormasyon ng sequence ang nalalaman tungkol sa disenyo ng primer.Halimbawa, kung ang pagkakasunud-sunod ng amino acid lamang ang nalalaman, ang merging primer ay maaaring idisenyo.Ang merger primer ay isang halo ng iba't ibang sequence na kumakatawan sa lahat ng iba't ibang posibilidad ng base na nag-encode ng isang amino acid.Upang madagdagan ang pagtitiyak, maaari kang sumangguni sa talahanayan ng paggamit ng codon upang mabawasan ang pagsasanib ayon sa mga kagustuhan sa paggamit ng iba't ibang mga organismo.Ang hypoxanthine ay maaaring ipares sa lahat ng mga base upang mabawasan ang annealing temperature ng primer.Huwag gamitin ang mga annexed base sa 3′ dulo ng primer dahil ang pagsusubo ng huling 3 base sa 3′ na dulo ay sapat na upang simulan ang PCR sa maling site.Ang mas matataas na konsentrasyon ng primer (1μM hanggang 3μM) ay ginagamit dahil ang mga primer sa maraming annexation mixture ay hindi partikular sa target na template.
Mga hilaw na materyales ng PCRkontrol
1. Dami ng panimulang aklat
Ang konsentrasyon ng bawat panimulang aklat ay 0.1 ~ 1umol o 10 ~ 100pmol.Mas mainam na makagawa ng kinakailangang resulta na may pinakamababang halaga ng panimulang aklat.Ang mataas na konsentrasyon ng panimulang aklat ay magdudulot ng mismatch at hindi partikular na amplification, at magpapataas ng pagkakataong bumuo ng mga dimer sa pagitan ng mga primer.
2. Primer konsentrasyon
Ang konsentrasyon ng mga panimulang aklat ay nakakaapekto sa pagtitiyak.Ang pinakamainam na konsentrasyon ng primer ay karaniwang nasa pagitan ng 0.1 at 0.5μM.Ang mas mataas na konsentrasyon ng primer ay humahantong sa pagpapalakas ng mga hindi tiyak na produkto.
3. Temperatura ng pagsusubo ng panimulang aklat
Ang isa pang mahalagang parameter para sa mga panimulang aklat ay ang temperatura ng pagkatunaw (Tm).Ito ang temperatura kapag ang 50% ng mga panimulang aklat at mga pantulong na pagkakasunud-sunod ay kinakatawan bilang mga double-stranded na molekula ng DNA.Kinakailangan ang Tm para itakda ang PCR annealing temperature.Sa isip, ang temperatura ng pagsusubo ay sapat na mababa upang matiyak ang epektibong pagsusubo ng mga panimulang aklat na may target na pagkakasunud-sunod, ngunit sapat na mataas upang mabawasan ang hindi tiyak na pagbubuklod.Makatwirang temperatura ng pagsusubo mula 55 ℃ hanggang 70 ℃.Ang temperatura ng pagsusubo ay karaniwang nakatakdang 5 ℃ na mas mababa kaysa sa Tm ng primer.
Mayroong ilang mga formula para sa pagtatakda ng Tm, na malaki ang pagkakaiba-iba depende sa formula na ginamit at ang pagkakasunud-sunod ng mga panimulang aklat.Dahil ang karamihan sa mga formula ay nagbibigay ng tinantyang halaga ng Tm, ang lahat ng temperatura ng pagsusubo ay panimulang punto lamang.Ang pagtitiyak ay maaaring mapabuti sa pamamagitan ng pagsusuri ng ilang mga reaksyon na unti-unting nagpapataas ng temperatura ng pagsusubo.Magsimula sa ibaba ng tinantyang Tm-5 ℃, at unti-unting taasan ang temperatura ng pagsusubo sa isang pagtaas ng 2 ℃.Ang mas mataas na temperatura ng pagsusubo ay magbabawas sa pagbuo ng mga primer na dimer at di-tiyak na mga produkto.Para sa pinakamahusay na mga resulta, ang dalawang panimulang aklat ay dapat magkaroon ng tinatayang mga halaga ng Tm.Kung ang pagkakaiba ng Tm ng mga pares ng primer ay higit sa 5 ℃, ang mga primer ay magpapakita ng isang makabuluhang maling pagsisimula sa pamamagitan ng paggamit ng mas mababang temperatura ng pagsusubo sa cycle.Kung magkaiba ang dalawang primer na Tm, itakda ang temperatura ng pagsusubo sa 5 ℃ na mas mababa kaysa sa pinakamababang Tm.Bilang kahalili, upang mapataas ang pagtitiyak, limang cycle ang maaaring gawin muna sa mga temperatura ng pagsusubo na idinisenyo para sa mas mataas na Tm, na sinusundan ng mga natitirang mga siklo sa mga temperatura ng pagsusubo na idinisenyo para sa mas mababang Tm.Nagbibigay-daan ito sa isang bahagyang kopya ng template ng patutunguhan na makuha sa ilalim ng mahigpit na mga kondisyon.
4. Primer kadalisayan at katatagan
Ang karaniwang kadalisayan ng mga custom na primer ay sapat para sa karamihan ng mga aplikasyon ng PCR.Ang pag-alis ng benzoyl at isobutylyl na grupo sa pamamagitan ng desalting ay minimal at samakatuwid ay hindi nakakasagabal sa PCR.Ang ilang mga application ay nangangailangan ng purification upang maalis ang anumang hindi buong-haba na mga sequence sa proseso ng synthesis.Ang mga pinutol na pagkakasunud-sunod na ito ay nangyayari dahil ang kahusayan ng chemistry ng DNA synthesis ay hindi 100%.Ito ay isang pabilog na proseso na gumagamit ng paulit-ulit na mga reaksiyong kemikal habang ang bawat base ay idinaragdag upang makagawa ng DNA mula 3′ hanggang 5′.Maaari kang mabigo sa alinmang cycle.Ang mas mahahabang primer, lalo na ang higit sa 50 base, ay may malaking proporsyon ng mga pinutol na pagkakasunud-sunod at maaaring mangailangan ng purification.
Ang ani ng mga panimulang aklat ay apektado ng kahusayan ng sintetikong kimika at paraan ng paglilinis.Ang mga kumpanyang biopharmaceutical, tulad ng Cytology at Shengong, ay gumagamit ng pinakamababang yunit ng OD upang matiyak ang kabuuang output ng oligonucleoside.Ang mga pasadyang panimulang aklat ay ipinadala sa dry powder form.Pinakamainam na muling matunaw ang mga panimulang aklat sa TE upang ang panghuling konsentrasyon ay 100μM.Ang TE ay mas mahusay kaysa sa deionized na tubig dahil ang pH ng tubig ay kadalasang acidic at magiging sanhi ng hydrolysis ng oligonucleosides.
Ang katatagan ng mga panimulang aklat ay nakasalalay sa mga kondisyon ng imbakan.Ang dry powder at dissolved primer ay dapat na naka-imbak sa -20 ℃.Ang mga primer na natunaw sa TE sa mga konsentrasyon na higit sa 10μM ay maaaring matatag na maiimbak sa -20℃ sa loob ng 6 na buwan, ngunit maaari lamang itago sa temperatura ng silid (15℃ hanggang 30℃) nang wala pang 1 linggo.Ang mga dry powder primer ay maaaring itago sa -20 C nang hindi bababa sa 1 taon at sa room temperature (15 C hanggang 30 C) nang hanggang 2 buwan.
5. Enzymes at ang kanilang mga konsentrasyon
Sa kasalukuyan, ang Taq DNA polymerase na ginamit ay karaniwang ang gene engineering enzyme na na-synthesize ng coliform bacteria.Ang dami ng enzyme na kailangan para ma-catalyze ang isang tipikal na reaksyon ng PCR ay humigit-kumulang 2.5U (tumutukoy sa kabuuang dami ng reaksyon na 100ul).Kung ang konsentrasyon ay masyadong mataas, maaari itong humantong sa hindi tiyak na amplification;kung ang konsentrasyon ay masyadong mababa, ang halaga ng sintetikong produkto ay mababawasan.
6. Kalidad at konsentrasyon ng dNTP
Ang kalidad ng dNTP ay malapit na nauugnay sa konsentrasyon at kahusayan ng PCR amplification.Ang dNTP powder ay butil-butil, at ang pagkakaiba-iba nito ay nawawala ang biological na aktibidad nito kung ito ay hindi wastong naimbak.Ang dNTP solution ay acidic, at dapat gamitin sa mataas na konsentrasyon, na may 1M NaOH o 1M Tris.HCL buffer solution upang ayusin ang PH nito sa 7.0 ~ 7.5, maliit na halaga ng sub-packaging, frozen na storage sa -20℃.Ang maramihang freeze-thawing ay magpapababa sa dNTP.Sa reaksyon ng PCR, ang dNTP ay dapat na 50 ~ 200umol/L.Lalo na, ang pansin ay dapat bayaran sa konsentrasyon ng apat na DNTPS ay dapat na pantay (pantay na paghahanda ng nunal).Kung ang konsentrasyon ng alinman sa mga ito ay iba sa iba (mas mataas o mas mababa), ang mismatch ay magdudulot.Ang masyadong mababang konsentrasyon ay makakabawas sa ani ng mga produkto ng PCR.Ang dNTP ay maaaring pagsamahin sa Mg2+ at bawasan ang konsentrasyon ng libreng Mg2+.
7. Template (target gene) nucleic acid
Ang dami at antas ng purification ng template na nucleic acid ay isa sa mga pangunahing link para sa tagumpay o pagkabigo ng PCR.Karaniwang gumagamit ng SDS at protease K ang tradisyunal na paraan ng paglilinis ng DNA upang matunaw at itapon ang mga specimen.Ang mga pangunahing pag-andar ng SDS ay: matunaw ang mga lipid at protina sa lamad ng cell, kaya sinisira ang lamad ng cell sa pamamagitan ng pagtunaw ng mga protina ng lamad, at ihiwalay ang mga nukleyar na protina sa cell, ang SDS ay maaari ding pagsamahin sa mga protina at namuo;Ang Protease K ay maaaring mag-hydrolyze at mag-digest ng mga protina, lalo na ang mga histone na nakatali sa DNA, at pagkatapos ay gumamit ng organikong solvent na phenol at chloroform upang mag-extract ng mga protina at iba pang bahagi ng cell, at gumamit ng ethanol o isopropyl alcohol upang mag-precipitate ng nucleic acid.Ang nakuhang nucleic acid ay maaaring gamitin bilang isang template para sa mga reaksyon ng PCR.Para sa pangkalahatang klinikal na pagtuklas ng mga specimen, ang isang mabilis at simpleng paraan ay maaaring gamitin upang matunaw ang mga cell, lysate pathogens, digest at alisin ang mga protina mula sa mga chromosome upang palayain ang mga target na gene, at direktang gamitin para sa PCR amplification.Ang RNA template extraction ay karaniwang gumagamit ng guanidine isothiocyanate o protease K na paraan upang maiwasan ang RNase na masira ang RNA.
8.konsentrasyon ng Mg2+
Ang Mg2+ ay may makabuluhang epekto sa pagtitiyak at ani ng PCR amplification.Sa pangkalahatang reaksyon ng PCR, kapag ang konsentrasyon ng iba't ibang dNTP ay 200umol/L, ang naaangkop na konsentrasyon ng Mg2+ ay 1.5 ~ 2.0mmol/L.Ang konsentrasyon ng Mg2+ ay masyadong mataas, ang pagtitiyak ng reaksyon ay bumababa, ang hindi tiyak na paglaki ay nangyayari, masyadong mababa ang konsentrasyon ay magbabawas sa aktibidad ng Taq DNA polymerase, na nagreresulta sa pagbawas ng mga produkto ng reaksyon.
Ang mga magnesium ions ay nakakaapekto sa ilang aspeto ng PCR, tulad ng aktibidad ng DNA polymerase, na nakakaapekto sa ani;Ang isa pang halimbawa ay ang panimulang pagsusubo, na nakakaapekto sa pagtitiyak.Ang dNTP at template ay nagbubuklod sa magnesium ion, na binabawasan ang dami ng libreng magnesium ion na kinakailangan para sa aktibidad ng enzyme.Ang pinakamainam na konsentrasyon ng magnesium ion ay nag-iiba-iba para sa iba't ibang mga pares ng primer at template, ngunit ang tipikal na panimulang konsentrasyon ng PCR na may 200μM dNTP ay 1.5mM (tandaan: Para sa real-time na quantitative na PCR, gumamit ng 3 hanggang 5mM na magnesium ion solution na may fluorescent probe).Ang mas mataas na konsentrasyon ng mga libreng magnesium ions ay nagpapataas ng ani, ngunit nagpapataas din ng hindi tiyak na amplification at nagpapababa ng katapatan.Upang matukoy ang pinakamainam na konsentrasyon, ang mga titration ng magnesium ion ay isinagawa sa mga pagtaas ng 0.5mM mula 1mM hanggang 3mM.Upang mabawasan ang pag-asa sa pag-optimize ng magnesium ion, maaaring gamitin ang Platinum Taq DNA polymerase.Nagagawa ng Platinum Taq DNA polymerase na mapanatili ang paggana sa mas malawak na hanay ng mga konsentrasyon ng magnesium ion kaysa sa Taq DNA polymerase at samakatuwid ay nangangailangan ng mas kaunting pag-optimize.
9. Pcr-promoting additives
Ang pag-optimize ng temperatura ng pagsusubo, disenyo ng panimulang aklat, at konsentrasyon ng magnesium ion ay sapat para sa lubos na tiyak na pagpapalakas ng karamihan sa mga template;gayunpaman, ang ilang mga template, kabilang ang mga may mataas na nilalaman ng GC, ay nangangailangan ng mga karagdagang hakbang.Ang mga additives na nakakaapekto sa temperatura ng pagkatunaw ng DNA ay nagbibigay ng isa pang paraan upang mapabuti ang pagiging tiyak at ani ng produkto.Ang buong denaturation ng template ay kinakailangan para sa pinakamahusay na mga resulta.
Bilang karagdagan, pinipigilan ng pangalawang istraktura ang panimulang pagbubuklod at pagpapalawak ng enzyme.
Ang mga additives ng PCR, kabilang ang formamide, DMSO, glycerin, betaine, at PCRx Enhancer Solution, ay nagpapahusay ng amplification.Ang kanilang posibleng mekanismo ay upang bawasan ang temperatura ng pagkatunaw, sa gayon ay tumutulong sa pagsusubo ng mga panimulang aklat at tumutulong sa pagpapalawig ng DNA polymerase sa pamamagitan ng rehiyon ng pangalawang istraktura.Ang PCRx Solution ay may iba pang mga pakinabang.Kinakailangan ang minimal na pag-optimize ng magnesium ion kapag ginamit kasama ng Platinum Taq DNA polymerase at Platinum Pfx DNA polymerase.Kaya, ang pamamaraan ng Platinum ay pinagsama sa additive upang madagdagan ang pagtitiyak habang binabawasan ang pagtitiwala sa ikatlong diskarte, ang pag-optimize ng magnesium ion.Para sa pinakamahusay na mga resulta, ang konsentrasyon ng mga additives ay dapat na i-optimize, lalo na ang DMSO, formamide, at glycerol, na pumipigil sa Taq DNA polymerase.
10. Mainit na simula
Ang mainit na pagsisimula ng PCR ay isa sa pinakamahalagang paraan upang mapabuti ang pagtitiyak ng PCR bilang karagdagan sa magandang disenyo ng panimulang aklat.Bagama't ang pinakamainam na temperatura ng pagpahaba ng Taq DNA polymerase ay 72 ℃, nananatiling aktibo ang polymerase sa temperatura ng silid.Kaya, ang mga di-tiyak na produkto ay ginawa kapag ang temperatura ng hawak ay mas mababa kaysa sa temperatura ng pagsusubo sa panahon ng paghahanda ng reaksyon ng PCR at sa simula ng thermal cycle.Kapag nabuo na, ang mga hindi partikular na produktong ito ay epektibong pinalalakas.Ang hot-start na PCR ay partikular na epektibo kapag ang mga site na ginagamit para sa panimulang disenyo ay nililimitahan ng lokasyon ng mga genetic na elemento, tulad ng site-directed mutations, expression cloning, o pagbuo at pagmamanipula ng mga genetic na elemento na ginagamit para sa DNA engineering.
Ang isang karaniwang paraan upang limitahan ang aktibidad ng Taq DNA polymerase ay ang paghahanda ng PCR reaction solution sa yelo at ilagay ito sa isang preheated PCR apparatus.Ang pamamaraang ito ay simple at mura, ngunit hindi nito nakumpleto ang aktibidad ng enzyme at samakatuwid ay hindi ganap na nag-aalis ng amplification ng mga di-tiyak na mga produkto.
Inaantala ng thermal priming ang synthesis ng DNA sa pamamagitan ng pagpigil sa isang mahalagang bahagi hanggang sa maabot ng PCR apparatus ang temperatura ng denaturation.Karamihan sa mga manu-manong pamamaraan ng thermal initiation, kabilang ang naantalang pagdaragdag ng Taq DNA polymerase, ay mahirap, lalo na para sa mga high-throughput na aplikasyon.Gumagamit ang iba pang paraan ng thermal priming ng wax shield upang ilakip ang isang mahalagang bahagi, kabilang ang mga magnesium ions o enzyme, o upang pisikal na ihiwalay ang mga reaktibong bahagi, gaya ng mga template at buffer.Sa panahon ng thermal cycle, ang iba't ibang bahagi ay inilalabas at pinaghalo habang ang wax ay natutunaw.Tulad ng manu-manong paraan ng pagsisimula ng mainit, ang paraan ng kalasag ng waks ay mahirap at madaling kapitan ng kontaminasyon at hindi angkop para sa mga aplikasyon ng mataas na throughput.
Ang Platinum DNA polymerase ay maginhawa at mahusay para sa awtomatikong mainit na pagsisimula ng PCR.Ang Platinum Taq DNA polymerase ay binubuo ng recombinant Taq DNA polymerase na sinamahan ng monoclonal antibody laban sa Taq DNA polymerase.Ang mga antibodies ay binuo ng PCR upang pigilan ang aktibidad ng enzyme sa panahon ng matagal na pagpigil sa temperatura.Ang Taq DNA polymerase ay inilabas sa reaksyon sa panahon ng 94 ℃ na pagkakabukod ng hakbang ng denaturation, na nagpapanumbalik ng buong aktibidad ng polymerase.Kabaligtaran sa chemically modified Taq DNA polymerase para sa thermal initiation, ang Platinum enzyme ay hindi nangangailangan ng matagal na pagkakabukod sa 94 ℃ (10 hanggang 15 minuto) upang i-activate ang polymerase.Sa PlatinumTaq DNA polymerase, 90% ng aktibidad ng Taq DNA polymerase ay naibalik pagkatapos ng 2 minuto sa 94 ℃.
11. Pugad-PCR
Ang sunud-sunod na pag-ikot ng amplification gamit ang mga nested primer ay maaaring mapabuti ang pagiging tiyak at pagiging sensitibo.Ang unang round ay isang karaniwang amplification ng 15 hanggang 20 cycle.Ang isang maliit na bahagi ng paunang produkto ng amplification ay natunaw ng 100 hanggang 1000 beses at idinagdag sa ikalawang round ng amplification para sa 15 hanggang 20 na mga cycle.Bilang kahalili, ang paunang amplified na produkto ay maaaring sukatin sa pamamagitan ng gel purification.Ang isang nested primer ay ginagamit sa ikalawang round ng amplification, na maaaring magbigkis sa target na sequence sa loob ng unang primer.Binabawasan ng paggamit ng nested PCR ang posibilidad ng amplification ng maraming target na site dahil kakaunti ang mga target na sequence na pantulong sa parehong set ng mga primer.Ang parehong kabuuang bilang ng mga cycle (30 hanggang 40) na may parehong mga panimulang aklat ay nagpalaki sa mga hindi tiyak na mga site.Pinapataas ng nested PCR ang sensitivity ng mga limitadong target na sequence (hal., rare mrnas) at pinapabuti ang specificity ng mahirap na PCRS (eg 5′ RACE).
12. Pababang PCR
Ang pababang PCR ay nagpapabuti sa pagiging tiyak sa pamamagitan ng paggamit ng mahigpit na mga kondisyon ng pagsusubo para sa unang ilang mga cycle ng PCR.Ang cycle ay nagsisimula sa isang annealing temperature na humigit-kumulang 5 ℃ na mas mataas kaysa sa tinantyang Tm, pagkatapos ang bawat cycle ay binabawasan ng 1 ℃ hanggang 2 ℃ hanggang ang annealing temperature ay mas mababa sa Tm 5 ℃.Tanging ang patutunguhang template na may pinakamataas na homology ang lalawak.Ang mga produktong ito ay patuloy na lumalawak sa mga kasunod na cycle, na nagsisisiksikan sa mga pinalakas na hindi partikular na produkto.Ang pababang PCR ay kapaki-pakinabang para sa mga pamamaraan kung saan ang antas ng homology sa pagitan ng primer at target na template ay hindi alam, gaya ng AFLP DNA fingerprinting.
Mga Kaugnay na PCR Kit
Ang 2× PCR HeroTMAng Mix system ay may mas mataas na tolerance sa PCR inhibitors kaysa sa ordinaryong PCR Mix system, at madaling makayanan ang PCR amplification ng iba't ibang kumplikadong template.Ang natatanging sistema ng reaksyon at mataas na kahusayan na Taq Hero ay ginagawang ang reaksyon ng PCR ay may mas mataas na kahusayan sa pagpapalakas, pagtitiyak at pagiging sensitibo.
Mas mataas na kahusayan sa amplification
Mayroon itong 5'→3' DNA polymerase activity at 5'→3' exonuclease activity, walang 3'→5' exonuclease activity.
Real Time PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
Ang partikular na—na-optimize na buffer at hot-start na Taq enzyme ay maaaring maiwasan ang hindi partikular na amplification at pagbuo ng primer dimer
High sensitivity—maaaring makakita ng mababang mga kopya ng template
RT-PCR Easyᵀᴹ I(Isang Hakbang)
Gumagamit ang kit ng isang natatanging Foregene reverse transcription reagent at Foregene HotStar Taq DNA Polymerase na pinagsama sa isang natatanging sistema ng reaksyon upang epektibong mapabuti ang kahusayan sa amplification at pagtitiyak ng reaksyon.
Oras ng post: Mayo-09-2023
