Kami ay may karanasan na tagagawa.Nanalo sa karamihan sa mahahalagang sertipikasyon ng merkado nito para sa Malaking diskwento sa China High Sensitivity One-Step Probe Rt-QpcrKit V2, Ang kalidad ay buhay ng pabrika, Ang pagtuunan ng pansin sa pangangailangan ng customer ay ang pinagmumulan ng kaligtasan at pag-unlad ng kumpanya, Sumusunod kami sa katapatan at mabuting saloobin sa pagtatrabaho, umaasa sa iyong pagdating!
Kami ay may karanasan na tagagawa.Panalong karamihan sa mahahalagang sertipikasyon ng merkado nito para saChina Taq DNA Polymerase, Qpcr, Nangako ang aming kumpanya: makatwirang mga presyo, maikling oras ng produksyon at kasiya-siyang serbisyo pagkatapos ng pagbebenta, tinatanggap ka rin namin na bisitahin ang aming pabrika anumang oras na gusto mo.Sana ngayon ay magkaroon tayo ng kaaya-aya at pangmatagalang negosyo na magkasama!!!

Mga paglalarawan

Gumagamit ang kit na ito ng kakaibang lysis buffer system na mabilis na makakapaglabas ng RNA mula sa mga kulturang sample ng cell para sa mga reaksyon ng RT-qPCR, at sa gayon ay inaalis ang nakakaubos ng oras at matrabahong proseso ng paglilinis ng RNA.Ang RNA template ay maaaring makuha sa loob lamang ng 7 minuto.Ang 5×Direct RT Mix at 2×Direct qPCR Mix-SYBR reagents na ibinigay ng kit ay maaaring mabilis at epektibong makakuha ng real-time na quantitative na mga resulta ng PCR.

Ang 5×Direct RT Mix at 2×Direct qPCR Mix-SYBR ay may malakas na inhibitor tolerance, at ang lysate ng mga sample ay maaaring direktang gamitin bilang template para sa RT-qPCR.Ang kit na ito ay naglalaman ng natatanging RNA high-affinity na Foregene reverse transcriptase, at Hot D-Taq DNA polymerase, dNTPs, MgCl₂, reaction buffer, PCR optimizer at stabilizer.

Mga pagtutukoy

200×20μl Rxns, 1000×20μl Rxns

Mga bahagi ng kit

Mga tampok at kalamangan

■ Simple at epektibo : gamit ang teknolohiyang Cell Direct RT, ang mga sample ng RNA ay maaaring makuha sa loob lamang ng 7 minuto.

■ Maliit ang sample demand, kasing baba ng 10 cell ang maaaring masuri.

■ Mataas na throughput: mabilis nitong matutukoy ang RNA sa mga cell na naka-culture sa 384, 96, 24, 12, 6-well plate.

■ Ang DNA Eraser ay maaaring mabilis na mag-alis ng mga inilabas na genome, lubos na mabawasan ang epekto sa mga kasunod na resulta ng eksperimentong.

■ Ang na-optimize na RT at qPCR system ay ginagawang mas mahusay ang two-step na RT-PCR reverse transcription at mas tiyak ang PCR, at mas lumalaban sa mga RT-qPCR reaction inhibitors.

Application ng kit

Saklaw ng aplikasyon: mga kulturang selula.

- RNA na inilabas sa pamamagitan ng sample lysis: naaangkop lamang sa template ng RT-qPCR ng kit na ito.

- Maaaring gamitin ang kit para sa mga sumusunod na layunin: pagsusuri sa expression ng gene, pag-verify ng epekto ng siRNA-mediated gene silencing, pagsusuri sa gamot, atbp.

Diagram

Imbakan at buhay ng istante

Ang Bahagi I ng kit na ito ay dapat na nakaimbak sa 4 ℃;Ang Bahagi II ay dapat na naka-imbak sa -20 ℃.

Ang Foregene Protease Plus II ay dapat na naka-imbak sa 4 ℃, huwag mag-freeze sa -20 ℃.

Reagent 2×Direct qPCR Mix-SYBR ay dapat na naka-imbak sa -20 ℃ sa dilim;kung madalas na ginagamit, maaari din itong itago sa 4 ℃ para sa panandaliang imbakan (gamitin sa loob ng 10 araw). Kami ay may karanasan sa tagagawa.Nanalo ng karamihan sa mga mahahalagang sertipikasyon ng merkado nito para sa Malaking diskwento sa China High Sensitivity One-Step Probe Rt-Qpcr Kit V2, Quality is factory' life , Tumuon sa demand ng customer ang pinagmumulan ng kaligtasan at pag-unlad ng kumpanya, Sumusunod kami sa katapatan at mabuting saloobin sa pagtatrabaho, umaasa sa iyong pagdating!
Malaking diskwentoChina Taq DNA Polymerase, Qpcr, Nangangako ang aming kumpanya: makatwirang presyo, maikling oras ng produksyon at kasiya-siyang serbisyo pagkatapos ng pagbebenta, tinatanggap ka rin namin na bisitahin ang aming pabrika anumang oras na gusto mo.Sana ngayon ay magkaroon tayo ng kaaya-aya at pangmatagalang negosyo na magkasama!!!

QuickEasyTM Cell Direct RT-qPCR Kit -Taqman

Cat.No.DRT-01021/01022

Para sa cell direct RT-qPCR gamit ang ≤ 1000,000 cells

Panimula ng produkto

Gumagamit ang produktong ito ng kakaibang lysis buffer system para mabilis na mailabas ang RNA mula sa mga kulturang sample ng cell para sa mga reaksyon ng RT-qPCR, inaalis ang nakakaubos ng oras at nakakapagod na proseso ng RNA purification, at 7 minuto lang para makuha ang kinakailangang template ng RNA, na may 5× Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman na ibinigay ng kit na mabilis at mahusay na makakakuha ng real-time na mga resulta ng PCR.

Ang 5× Direct RT Mix at 2× Direct qPCR Mix-Taqman ay may malakas na inhibitor tolerance at maaaring magsagawa ng mahusay na pagbaligtad at partikular na amplification gamit ang lysate ng sample na susukatin bilang template.Ang reagent ay naglalaman ng Foregene Reverse Transcriptase, Hot D-Taq DNA Polymerase, dNTPs, MgCl₂, Reaction Buffer, PCR Optimizer at Stabilizer, na maaaring gamitin kasama ng lysis buffer para mabilis at madaling makakita ng mga sample, at may mga katangian ng mataas na sensitivity, specificity at stability.

Mga Tampok ng Produkto

Simple, epektibong Cell Direct RT na teknolohiya na tumatagal ng kasing liit ng 7 minuto upang makakuha ng mga sample ng RNA.

Ang mga sample na kinakailangan ay maliit, at hindi bababa sa 10 kulturang cell ang maaaring gamitin para sa pag-eeksperimento.

Mataas na throughput para sa mabilis na pagkuha ng RNA ng mga nakakulturang cell gaya ng 384, 96, 24, 12, at 6-well plate.

Nagagawang mabilis na alisin ng DNA Eraser ang mga inilabas na genome, na lubos na binabawasan ang epekto sa mga kasunod na resulta ng eksperimentong.

Ang mga na-optimize na RT at qPCR system ay nagbibigay-daan sa dalawang hakbang na RT-PCR na may mas mahusay na reverse transcription, specificity, at mas malakas na RT-qPCR reaction inhibitor tolerance.

Application ng kit

Saklaw ng aplikasyon: Mga kulturang selula.

Sample lysis interpreted RNA: ginamit lang bilang two-step RT-qPCR template.

Maaaring gamitin ang mga kit para sa mga sumusunod na layunin: pagsusuri sa pagpapahayag ng regulasyon ng gene, pagsusuri sa allele, pagsusuri sa gamot, atbp.

Mga limitasyon ng kit

Mga amplified na fragment ≤ 300 bp.

Ang mga kit ay ginagamit sa bagong kultura ng mga cell.

Kontrol sa kalidad ng produkto

Ayon sa Total Quality Management System ng FOREGENE, ang bawat batch ng Cell Direct RT-qPCR series kit ay mahigpit na sinusuri nang maraming beses upang matiyak ang pagiging maaasahan at katatagan ng kalidad ng bawat batch ng mga kit.

Mga nilalaman ng kit

*:Ang Cell Lysis, 5×Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman ay maaaring bilhin nang hiwalay, ang mga detalye ay ibinigay sa Appendix 1 (PAGE 13).

Mga kondisyon ng imbakan

1. Mga Kundisyon sa Pagpapadala

Ang buong proseso ng mababang temperatura na ice pack box na transportasyon, upang matiyak na ang kit ay nasa <4 °C na estado.

2. Mga kondisyon ng imbakan

Itabi ang bahagi I sa 4°C at Bahagi II sa -20°C.

Ang Foregene Protease Plus II ay dapat na nakaimbak sa 4°C, hindi nagyelo sa -20°C.

Ang Reagent 2× Direct qPCR Mix-Taqman ay iniimbak sa -20°C, o sa 4°C para sa panandaliang paggamit kung madalas gamitin (sa loob ng 10 araw).

Impormasyon sa bahagi ng kit

Buffer CL: Nagbibigay ng kapaligirang kinakailangan para sa mga reaksyon ng cell lysis.

Buffer ST: Tinatanggal ang aktibong sangkap sa lysate upang maiwasan ang mga epekto sa kasunod na RT.

DNA Eraser: DNA remover, ang epekto ng pag-alis ng genome sa mga susunod na eksperimento.

5× Direct RT Mix: Naglalaman ng mataas na RNA affinity na Foregene Reverse Transcriptase, RNase Inhibitor, dNTP, stabilizer, enhancer, optimizer, at reverse transcription primer para sa pinakamainam na alignment (Random Primer, Oligo(dT)₁₈Primer).

Foregene Protease Plus II: Sa konteksto ng lysis buffer, ang mga cell ay lysed upang maglabas ng mga nucleic acid.

2× Direct qPCR Mix-Taqman: Ang reagent na ito ay naglalaman ng Hot D-Taq DNA Polymerase, dNTPs, MgCl₂, reaction buffer, PCR optimizer, at stabilizer.

20× ROX Reference Dye: Karaniwang ginagamit sa Real Time PCR amplification instruments ng ABI, Stratagene at iba pang kumpanya, ito ay ginagamit upang ayusin ang pagkakaiba sa pagitan ng PCR tubes at tubes na dulot ng PCR dosing errors.Ang 20× ROX Reference Dye concentration na kinakailangan para sa iba't ibang instrumento ay iba, at maaaring idagdag ito ng user ayon sa inirerekomendang konsentrasyon ng instrumento.

RNase-Free ddH₂O: RNase-free sterilized ultra pure water para sa dalawang-hakbang na RT-qPCR na mga reaksyon.

Mga pag-iingat:(Siguraduhing basahin nang mabuti ang mga pag-iingat bago gamitin ang kit)

Bigyang-pansin ang paraan ng pagpapatakbo ng eksperimento upang maiwasan ang cross-contamination sa pagitan ng mga sample.

Bigyang-pansin ang kalinisan ng pang-eksperimentong kapaligiran at mga kagamitan upang maiwasan ang kontaminasyon ng RNase at pagkasira ng RNA.

Kumuha ng sariwa o mahusay na napreserbang mga sample ng cell at huwag gumamit ng paulit-ulit na freeze-thawed na mga sample ng cell.

5× Direktang qPCR Mix,2× Direktang qPCR Mix-Taqman ay dapat na maiwasan ang paulit-ulit na freeze-thaw, kung hindi, ito ay makakaapekto sa reverse transcription at PCR na kahusayan.

Preparasyondatioperasyon

Siguraduhing basahin nang mabuti ang mga tagubilin bago gamitin ang kit na ito.Ang Cell Direct RT-qPCR Kit ay simple, maginhawa, at mabilis na patakbuhin, at ang mga tagubilin ay nagbibigay ng kumpletong impormasyon tungkol sa buong kit at kung paano ito gamitin nang tama.Mangyaring ihanda ang mga kinakailangang pang-eksperimentong materyales at kagamitan bago gamitin.

Mga pang-eksperimentong materyales at kagamitan

◆ Mga selula ng kultura.

◆ 1.5 ml o 2 ml, RNase-/DNase-Free centrifuge tube, RNase-/DNase-Free tip, 0.2 ml sterile qPCR tube.

◆ qPCR machine, pipette, tabletop centrifuge (≥13,400×g) (depende sa mga pang-eksperimentong pangangailangan), atbp.

Kaligtasan

◆ Ang produktong ito ay para sa mga layunin ng siyentipikong pananaliksik lamang, mangyaring huwag gamitin ito para sa mga layuning parmasyutiko, klinikal, pagkain at kosmetiko.

◆ Kapag gumagamit ng mga kemikal, magsuot ng angkop na damit sa laboratoryo, guwantes, salaming pang-proteksyon, atbp.

Operasyonmga gabay

Ang mga cell Lysis system, RT system, at qPCR reaction solution supplement pack ay maaaring bilhin nang hiwalay, para sa mga detalye sa Appendix 1 (PAGE 13).

Gabay sa pagpapatakbo

A: Sample na paglabas ng RNA

1. Ang mga cell ay pretreated: Hugasan ang cell culture plate na may malamig na PBS, pagkatapos ay i-lyse ang mga cell (10-10⁶), 10⁶ kaysa sa dami ng mga cell, inirerekomenda ang Foregene the Cell at RNA Isolation Kit ang Total (DE-03111) o Animal Total RNA Isolation Kit (DE-03011) para sa RNA extraction at purification.

1.1.Adherent cells (24- well plate bilang isang halimbawa)

1.1.1.Tukuyin ang bilang ng mga cell sa bawat balon, tukuyin na ang bilang ng mga cell ay 1 × 10⁵, at gumamit ng pipette para alisin ang culture medium mula sa culture dish.

1.1.2.Magdagdag ng 200 μl ng pre-chilled 1 × PBS sa bawat balon.Huwag mag-pipet nang paulit-ulit at alisin ang PBS sa mga balon.Ikiling ang plato at alisin ang mas maraming PBS hangga't maaari.Magpatuloy sa hakbang 2.

1.1.3.Iba't ibang cell culture dish o isang reference number table 1-1 sa isang cell culture dish ay idinagdag na precooled 1 × PBS para sa cell washing.

Talahanayan 1-1: Dosis ng PBS para sa iba't ibang bilang ng mga cell

Tandaan：Upang matiyak ang isang matatag na sumusunod na mga cell,isang malaking bilang ng pagkawala ng cell ang naiwasan kapag naghuhugas.

1.2.Mga suspension cell o adherent cell na na-culture sa non-porous plate

1.2.1.Ang mga adherent cell na naka-culture sa non-multi well plates (suspension cells ay magsisimula sa susunod na hakbang 1.2.2), kolektahin at paghiwalayin ang mga cell ayon sa normal na paraan ng koleksyon ng cell, at ilagay ang mga ito sa isang culture plate o centrifuge tube;kung ginagamit ang trypsinization, nangangailangan ng centrifugation upang kolektahin ang mga cell at upang alisin ang natitirang trypsin, idinagdag ang PBS resuspended na mga cell sa mga indibidwal na mga cell upang ikalat ang mga cell.

1.2.2.Matapos mabilang ang bilang ng mga cell, na-aliquote ang mga cell na 1×10⁵ isa sa centrifuge tubes, kolektahin ang mga cell sa pamamagitan ng centrifugation sa 1000 × g sa loob ng 10 min.

1.2.3.Magdagdag ng 200 μl PBS sa centrifuge tube, huwag i-pipet nang paulit-ulit, at direktang i-aspirate ang PBS.magpatuloy sa hakbang 2. (Kung mahirap mag-precipitate at ang mga cell ay muling nasuspinde, maaaring gawin 1000×g centrifuged 10 min pagkatapos itapon ang supernatant, ang cell pellet ay magpatuloy sa hakbang 2)

2.Cell lysis: Alisin ang Buffer CL, ang temperatura nito ay equilibrate sa room temperature, DNA Eraser at Foregene Protease Plus II, ayon sa sumusunod na talahanayan 1-2 na inihandang lysis system: (Handa nang gamitin ang Lysis solution).

Talahanayan 1-2: cleavage paghahanda ng system (Tandaan: sa paghahanda sa yelo)

3.( 24 –well plate bilang isang halimbawa ) Pipette 200 μl ng cell lysis master mix sa bawat balon, Paulit-ulit na pumutok ng 5-10 beses, Incubate sa room temperature (20-25 ℃ ) sa loob ng 5 min.

Tandaan：Upang maiwasan ang pagbuo ng mga bula, mangyaring kapag ang pipetting pipette scale ay naayos sa 200μl o mas mababa.Ang mga selula ay maaaring lumitaw na maulap pagkatapos ng lysis, na normal.

4.(24 –well plate bilang isang halimbawa) ay idinagdag sa likidong 20 μl Buffer ST (iba't ibang lysis system Buffer ST na idinagdag sa isang halagang ipinapakita sa Talahanayan 1-3), paulit-ulit na pagpi-pipet ng 5-10 beses, sa temperatura ng silid(20-25 ℃) ay incubated para sa 2 min.

Tandaan：Ang dulo ng pipette ay itinapon sa ibaba ng ibabaw, na tinitiyak na ang lysate ay idinagdag,upang maiwasan ang pagbuo ng mga bula, mangyaring kapag ang pipetting pipette scale ay nababagay sa 200μl o mas mababa.

Talahanayan 1-3：Magdagdag ng Buffer ST

5.Ang lysate ay ginagamit para sa kasunod na mga eksperimento sa RT-qPCR.Kung ang mga kasunod na eksperimento ay hindi maisagawa sa oras, mangyaring panatilihin ito sa yelo nang hindi hihigit sa 2 oras, at iimbak sa -20 ℃ o -80 ℃ ( hindi hihigit sa tatlong buwan ).

B: Paghahanda ng sistema ng RT

1. Ilabas ang 5 × Direct RT Mix at ilagay ito sa isang ice bath, hayaan itong matunaw nang natural, at dahan-dahang ihalo para magamit sa ibang pagkakataon;kumuha ng RNase-Free ddH2O at tunawin ito at ilagay sa isang ice bath para magamit sa ibang pagkakataon.Ihanda ang sistema ng reaksyon sa yelo ayon sa Talahanayan 2-1 sa ibaba.

Talahanayan 2-1: Paghahanda ng RT reaction system

2.Pagkatapos ng pagkumpleto ng system formulation, dahan-dahang halo-halong at sentripuge sandali sa sumusunod na talahanayan 2 -2 reaksyon kondisyon RT reaksyon.

Talahanayan 2-2: Setting ng kundisyon ng RT Reaction

3.Pagkatapos makumpleto ang reaksyon, ang produkto ng reaksyon ay direktang inilagay sa yelo para sa qPCR, mangyaring ilagay ang pangmatagalang pangangalaga -20 ℃ o -80 ℃ .

Tandaan: Dahil sa paggamit ng hindi na-purified na template, maaaring lumabas ang mga puting precipitate sa reverse transcription product.Ito ay isang normal na kababalaghan.I-centrifuge kaagad ang supernatant para sa mga susunod na eksperimento.

Ang resultang RT reaction solution ay idinagdag sa susunod na Hakbang Real Time PCR reaction system, inirerekomendang magdagdag ng mga halaga mula 10-30% ng reaction system.

C: paghahanda ng sistema ng reaksyon ng qPCR

1. Angkop na dami ng B na inihanda sa hakbang na cDNA template ayon sa sumusunod na talahanayan 3-1 upang maghanda ng isang sistema ng reaksyon.

Tandaan: Ang halaga ng template ng cDNA ay para sa 10-30% ng qPCR system.Halimbawa, sa isang 20μl qPCR system, magdagdag ng 2-6 μl ng lysis buffer, ngunit hindi hihigit sa 6 μl.

2. Ang mahusay na pag-optimize ng mga kondisyon ng qPCR (Temperatura ng pagsusubo, atbp.) para sa reaksyon ng qPCR (Ang mga kondisyon ng reaksyon na ibinigay sa Talahanayan 3-2).

Tandaan: Subukang gumamit ng mga naka-optimize na kundisyon para sa mga reaksyon ng qPCR upang makakuha ng mas magagandang resulta.

Talahanayan 3-1: Paghahanda ng PCR reaction system

1*: Maaaring iakma ang konsentrasyon ng panimulang aklat sa hanay na 50-900 nM kapag mahina ang pagganap ng primer na reaksyon.

Tandaan: Maaaring isaayos ang qPCR system ayon sa mga pang-eksperimentong pangangailangan at modelo ng fluorescence cycler.Para sa qPCR sa isang 50μl system, ayusin ang dosis ng reagent nang proporsyonal ayon sa 20μl sistema.

2*: Piliin ang naaangkop na panghuling konsentrasyon ng ROX Reference Dye ayon sa fluorescence quantitative thermal cycler.Ang pinakaangkop na ROX Reference Dye concentrations para sa karaniwang fluorescence quantitative cyclers ay ipinapakita sa talahanayan sa ibaba:

Talahanayan 3-2: Ang mga kondisyon ng reaksyon ng qPCR ay ibinigay

Tandaan: Upang makuha ang pinakamahusay na qPCR effect, maaaring gamitin ang gradient PCR para i-optimize ang mga kondisyon ng reaksyon para sa iba't ibang template at iba't ibang primer.Ang mga kondisyon ng reaksyon ng PCR ay nag-iiba depende sa fluorescence analyzer, template, primer, atbp. Sa partikular na operasyon, ang pinakamainam na kondisyon ng reaksyon ay kailangang idisenyo ayon sa mga partikular na kondisyon ng fluorescence quantitative thermal cycler, uri ng template, laki ng fragment ng interes, base sequence ng amplified fragment at GC na nilalaman at haba ng mga primer, kabilang ang temperatura ng pagsusubo, oras ng reaksyon, atbp.

Real Time PCR primer na mga prinsipyo sa disenyo

Forward Primer at Reverse Primer

Para sa Real Time PCR, napakahalaga ng disenyo ng panimulang aklat.Ang mga panimulang aklat ay nauugnay sa pagtitiyak at kahusayan ng PCR amplification, at maaaring idisenyo na may kaugnayan sa mga sumusunod na prinsipyo:

◆ Haba ng panimulang aklat: 18-30bp.

◆ Nilalaman ng GC: 40-60%.

◆ Halaga ng Tm: Ang software ng disenyo ng panimulang aklat, tulad ng Primer 5, ay maaaring magbigay ng halaga ng Tm ng panimulang aklat.Ang mga halaga ng Tm ng upstream at downstream na mga primer ay dapat na mas malapit hangga't maaari.Ang formula ng pagkalkula ng Tm ay maaari ding gamitin: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).Kapag nagsasagawa ng PCR, ang temperaturang mas mababa sa halaga ng primer na Tm na 5 °C ay karaniwang pinipili bilang temperatura ng pagsusubo (ang katumbas na pagtaas ng temperatura ng pagsusubo ay maaaring tumaas ang pagtitiyak ng reaksyon ng PCR).

◆ Mga panimulang aklat at produkto ng PCR:

◆ Design primer PCR amplification haba ng produkto ay mas mabuti na 100-150bp.

◆ Ang mga panimulang disenyo sa pangalawang bahagi ng istruktura ng template ay dapat na iwasan hangga't maaari.

◆ Iwasan ang pagbuo ng 2 o higit pang mga complementary base sa pagitan ng 3′ dulo ng upstream at downstream primers.

◆ Primer 3′ terminal base ay hindi maaaring naroroon na may 3 karagdagang magkakasunod na G o C.

◆ Ang mga primer mismo ay hindi maaaring magkaroon ng mga pantulong na istruktura, kung hindi, isang istraktura ng hairpin ay mabubuo, na makakaapekto sa PCR amplification.

◆ Ang ATCG ay dapat na ipamahagi nang pantay-pantay hangga't maaari sa primer sequence, at ang 3′ terminal base ay dapat na iwasan bilang T.

Apendise1：Cell DirektaRT-qPCR Kit component supplement pack

1.Cell Lysis Solution