Kilalang-kilala na sa gitnang dogma, ang RNA ay ang transcriptional mediator sa pagitan ng DNA at expression ng protina.Kung ikukumpara sa pagtuklas ng DNA, ang pagtuklas ng RNA ay maaaring mas obhetibong sumasalamin sa pagpapahayag ng gene sa mga organismo.Kasama sa mga eksperimento na kinasasangkutan ng RNA ang: qRT-PCR, RNA-Seq, at fusion gene detection, atbp. Batay sa mga katangian ng RNA mismo (ang sugar ring ng RNA ay may isa pang libreng hydroxyl group kaysa sa sugar ring ng DNA), kasama ng malaking bilang ng RNases sa kapaligiran, ang RNA ay mas hindi matatag at mas madaling masira kaysa sa DNA.Basura sa loob, basura palabas, kung ang kalidad ng RNA ay hindi maganda, kung gayon ang mga eksperimentong resulta ay dapat na hindi kasiya-siya, partikular na ipinahayag bilang hindi tumpak na data o mahinang repeatability.Samakatuwid, ang higit na pansin ay dapat bayaran sa pagproseso ng RNA, at ang link ng kontrol sa kalidad ay mas mahalaga din upang matiyak ang katumpakan at katumpakan ng kasunod na pang-eksperimentong data.

Para sa kontrol ng kalidad ng RNA, karaniwang mayroong mga sumusunod na karaniwang ginagamit na pamamaraan:

• Spectrophotometry
• agarose gel electrophoresis
• Agilent Bioanalyzer
• real-time na fluorescent quantitative PCR
• Qubit fluorescent dye method

01 Spectrophotometry

Ang RNA ay may conjugated double bond at may absorption peak sa wavelength na 260nm.Ayon sa batas ng Lambert-Beer, maaari nating kalkulahin ang konsentrasyon ng RNA mula sa peak ng pagsipsip sa 260nm.Bilang karagdagan, maaari din nating kalkulahin ang kadalisayan ng RNA ayon sa ratio ng 260nm, 280nm at 230nm absorption peaks.Ang 280nm at 230nm ay ang mga tuktok ng pagsipsip ng mga protina at maliliit na molekula, ayon sa pagkakabanggit.Ang ratio ng A260/A280 at A260/A230 ng kwalipikadong RNA purity ay dapat na higit sa 2. Kung ito ay mas mababa sa 2, nangangahulugan ito na may protina o maliit na molecule na kontaminasyon sa sample ng RNA at kailangang purified muli.Ang mga pinagmumulan ng kontaminasyon ay makakaapekto sa mga eksperimento sa ibaba ng agos, tulad ng pagpigil sa kahusayan ng amplification ng mga reaksyon ng PCR, na nagreresulta sa hindi tumpak na mga resulta ng dami.Ang kadalisayan ng RNA ay may malaking impluwensya sa mga kasunod na resulta, kaya ang spectrophotometry sa pangkalahatan ay isang kailangang-kailangan na link ng kontrol sa kalidad sa unang hakbang sa mga eksperimento ng nucleic acid.

Figure 1. Karaniwang RNA/DNA Absorption Spectrum

02 Agarose gel electrophoresis

Bilang karagdagan sa kadalisayan, ang integridad ng RNA ay isa rin sa mga mahalagang tagapagpahiwatig para sa paghusga sa kalidad ng RNA.Ang pagkasira ng RNA ay hahantong sa isang malaking bilang ng mga maiikling fragment sa sample, kaya ang bilang ng mga RNA fragment na mabisang matukoy at sakop ng reference sequence ay mababawasan.Ang integridad ng RNA ay maaaring suriin sa pamamagitan ng electrophoresis ng kabuuang RNA sa isang 1% agarose gel.Maaaring i-configure ng paraang ito ang gel nang mag-isa, o gamitin ang prefabricated na E-Gel™ System para sa pagsusuri ng integridad.Higit sa 80% ng kabuuang RNA ay ribosomal RNA, na ang karamihan ay binubuo ng 28S at 18S rRNA (sa mga mammalian system).Ang magandang kalidad na RNA ay magpapakita ng dalawang halatang maliwanag na bar, na 28S at 18S na maliliwanag na bar, ayon sa pagkakabanggit, sa 5 Kb at 2 Kb, at ang ratio ay malamang na malapit sa 2:1.Kung ito ay nasa isang nagkakalat na estado, nangangahulugan ito na ang sample ng RNA ay maaaring nasira, at inirerekumenda na gamitin ang pamamaraang inilarawan sa ibang pagkakataon upang higit pang subukan ang kalidad ng RNA.

Figure 2. Paghahambing ng degraded (lane 2) at intact RNA (lane 3) sa agarose gel electrophoresis

03 Agilent Bioanalyzer

Bilang karagdagan sa paraan ng agarose gel electrophoresis na inilarawan sa itaas, na makakatulong sa amin na matukoy ang integridad ng RNA nang simple at mabilis, maaari rin naming gamitin ang Agilent bioanalyzer upang matukoy ang integridad ng RNA.Gumagamit ito ng kumbinasyon ng microfluidics, capillary electrophoresis, at fluorescence upang masuri ang konsentrasyon at integridad ng RNA.Sa pamamagitan ng paggamit ng built-in na algorithm upang pag-aralan ang profile ng sample ng RNA, maaaring kalkulahin ng Agilent bioanalyzer ang isang reference na halaga ng integridad ng RNA, RNA Integrity Number (simula dito ay tinutukoy bilang RIN) [1].Kung mas malaki ang halaga ng RIN, mas mataas ang integridad ng RNA (ang 1 ay lubhang nasiraan ng loob, 10 ang pinakakumpleto).Ang ilang mga eksperimento na kinasasangkutan ng RNA ay nagmumungkahi ng paggamit ng RIN bilang isang parameter para sa pagtatasa ng kalidad.Ang pagkuha ng mga high-throughput na sequencing na mga eksperimento (mula dito ay tinutukoy bilang NGS) bilang isang halimbawa, ang mga alituntunin ng Oncomine™ Human Immune Repertoire, na ginagamit upang makita ang B cell at T cell antigen receptors sa Thermo Fisher's Oncomine panel series, ay nagmumungkahi na ang mga sample na may mga halaga ng RIN na mas mataas sa 4, Mas mabisang pagbabasa at clone ay maaaring masukat 3 (Figure).Mayroong iba't ibang inirerekomendang hanay para sa iba't ibang panel, at kadalasan ang mas mataas na RIN ay maaaring magdala ng mas epektibong data.

Figure 3, sa mga eksperimento ng Oncomine™ Human Immune Repertoire, ang mga sample na may RIN na higit sa 4 ay makaka-detect ng mas epektibong mga read at T cell clone.【2】

Gayunpaman, ang halaga ng RIN ay mayroon ding ilang mga limitasyon.Bagaman may mataas na ugnayan ang RIN sa kalidad ng data ng pang-eksperimentong NGS, hindi ito angkop para sa mga sample ng FFPE.Ang mga sample ng FFPE ay ginagamot ng kemikal sa loob ng mahabang panahon, at ang nakuhang RNA sa pangkalahatan ay may medyo mababang halaga ng RIN.Gayunpaman, hindi ito nangangahulugan na ang epektibong data ng eksperimento ay dapat na hindi kasiya-siya.Upang tumpak na masuri ang kalidad ng mga sample ng FFPE, kailangan naming gumamit ng mga sukat maliban sa RIN.Bilang karagdagan sa RIN, maaari ding kalkulahin ng Agilent bioanalyzer ang halaga ng DV200 bilang isang parameter ng pagsusuri ng kalidad ng RNA.Ang DV200 ay isang parameter na kinakalkula ang proporsyon ng mga fragment na mas malaki sa 200 bp sa isang sample ng RNA.Ang DV200 ay isang mas mahusay na tagapagpahiwatig ng kalidad ng sample ng FFPE kaysa sa RIN.Para sa RNA na nakuha ng FFPE, mayroon itong napakataas na ugnayan sa bilang ng mga gene na mabisang matukoy at ang pagkakaiba-iba ng mga gene [3].Bagama't kayang bawiin ng DV200 ang mga kakulangan sa pagtuklas ng kalidad ng FFPE, hindi pa rin komprehensibong pag-aralan ng Agilent bioanalyzer ang mga problema sa kalidad sa mga sample ng RNA, kabilang kung mayroong mga inhibitor sa mga sample.Ang mga inhibitor mismo ay maaaring makaapekto sa kahusayan ng amplification ng mga eksperimento sa ibaba ng agos at bawasan ang dami ng kapaki-pakinabang na data.Upang malaman kung mayroong isang inhibitor sa sample, maaari nating gamitin ang real-time na fluorescent quantitative na pamamaraan ng PCR na inilarawan sa susunod.

04 real-time na fluorescent quantitative PCR

Ang real-time na fluorescent quantitative PCR na pamamaraan ay hindi lamang makakakita ng mga inhibitor sa sample, ngunit tumpak din na sumasalamin sa kalidad ng RNA sa sample ng FFPE.Kung ikukumpara sa mga Agilent biological analyzer, ang real-time na fluorescence quantitative na mga instrumento ay mas popular sa mga pangunahing biological laboratories dahil sa kanilang mas malawak na aplikasyon.Para masubukan ang kalidad ng mga sample ng RNA, kailangan lang naming bumili o maghanda ng mga primer na probe para sa mga internal na reference na gene, gaya ng GUSB (Cat no. Hs00939627).Sa pamamagitan ng paggamit sa hanay ng mga panimulang aklat, probe at pamantayan na ito (kabuuang RNA ng kilalang konsentrasyon) upang magsagawa ng ganap na dami ng mga eksperimento, ang epektibong konsentrasyon ng fragment ng RNA ay maaaring kalkulahin bilang pamantayan sa pagsusuri ng kalidad ng RNA (Functional RNA Quantitation (FRQ) para sa maikli).Sa isang pagsubok ng NGS, nalaman namin na ang FRQ ng mga sample ng RNA ay may napakataas na ugnayan sa epektibong dami ng data.Para sa lahat ng mga sample na higit sa 0.2ng/uL FRQ, hindi bababa sa 70% ng mga nabasa ang maaaring epektibong masakop ang pagkakasunud-sunod ng sanggunian (Larawan 4).

Figure 4, ang halaga ng FRQ na nakita ng fluorescence quantitative method ay may napakataas na ugnayan (R2>0.9) kasama ang epektibong data na nakuha sa eksperimento ng NGS.Ang pulang linya ay ang halaga ng FRQ na katumbas ng 0.2 ng/uL (log10 = -0.7).【4】

Bilang karagdagan sa pagiging naaangkop sa mga sample ng FFPE, ang real-time na quantitative na paraan ng PCR ay maaari ding epektibong masubaybayan ang mga inhibitor sa mga sample.Maaari naming idagdag ang sample na matutukoy sa reaction system na may Internal Positive Control (IPC) at Assay nito, at pagkatapos ay magsagawa ng fluorescence quantification para makuha ang Ct value.Kung ang halaga ng Ct ay nahuhuli sa halaga ng Ct sa no-sample na reaksyon, ipinapahiwatig nito na ang inhibitor ay naroroon sa sample at pinipigilan ang kahusayan ng amplification sa reaksyon.

05 Qubit fluorescent dye method

Ang Qubit Fluorometer ay ang pinakakaraniwang ginagamit na maliit na aparato para sa konsentrasyon ng nucleic acid at pagtukoy ng kadalisayan, na madaling gamitin at umiiral sa halos lahat ng molecular biology laboratory.Ito ay tumpak na kinakalkula ang konsentrasyon ng nucleic acid sa pamamagitan ng pag-detect at nucleic acid-binding fluorescent dye (Qubit detection reagent).Ang Qubit ay may mataas na sensitivity at specificity, at maaaring tumpak na mabilang ang RNA hanggang sa pg/µL na konsentrasyon.Bilang karagdagan sa kilalang kakayahan upang tumpak na mabilang ang konsentrasyon ng nucleic acid, ang pinakabagong bagong modelo ng Thermo Fisher, Qubit 4.0, ay maaari ding makakita ng integridad ng RNA.Nakikita ng Qubit 4.0's RNA detection system (RNA IQ Assay) ang integridad ng RNA sa pamamagitan ng sabay na pagtuklas ng dalawang partikular na fluorescent dyes.Ang dalawang fluorescent dyes na ito ay maaaring magbigkis sa malalaking fragment at maliliit na fragment ng RNA, ayon sa pagkakabanggit.Ang dalawang fluorescent dyes na ito ay nagpapahiwatig ng proporsyon ng malalaking fragment ng RNA sa sample, at mula dito ang halaga ng IQ (Integridad at Kalidad) na kumakatawan sa kalidad ng RNA ay maaaring kalkulahin.Ang halaga ng IQ ay naaangkop sa parehong FFPE at hindi FFPE na mga sample, at may malaking impluwensya sa kasunod na kalidad ng pagkakasunud-sunod.Isinasaalang-alang ang mga eksperimento ng NGS bilang isang halimbawa, sa mga eksperimento sa pagsubok ng RNA-Seq na isinagawa sa platform ng Ion torrent™, karamihan sa mga sample na may mga halaga ng IQ na higit sa 4 ay may hindi bababa sa 50% na epektibong pagbabasa (Larawan 5).Kung ikukumpara sa mga nabanggit na paraan ng pag-detect, ang Qubit IQ Assay ay hindi lamang mas maginhawang gumana at tumatagal ng mas kaunting oras (sa loob ng limang minuto), ngunit mayroon ding mahusay na ugnayan sa pagitan ng sinusukat na parameter na halaga ng IQ at ang kalidad ng data ng mga eksperimento sa ibaba ng agos.

Figure 5, mayroong isang mahusay na ugnayan sa pagitan ng halaga ng Qubit RNA IQ at ang mga naka-map na pagbabasa ng RNA-Seq.【5】

Sa pamamagitan ng pagpapakilala sa itaas, naniniwala ako na ang bawat isa ay may sapat na pag-unawa sa iba't ibang paraan ng pagkontrol sa kalidad ng RNA.Sa pagsasanay, maaari kang pumiliang kaukulang pamamaraan ayon sa uri ng sample at umiiral na mga instrumento.Sa pamamagitan lamang ng mahusay na pagkontrol sa kalidad ng RNA maiiwasan natin ang kabiguan ng mga kasunod na eksperimento na dulot ng mahinang kalidad ng sample, kaya nakakatipid ng mahalagang oras, enerhiya at gastos.

Mga produkto ng sanggunian:

Animal Total RNA Isolation Kit

Cell Total RNA Isolation Kit

mga sanggunian

【1】Schroeder, A., Mueller, O., Stocker, S. et al.Ang RIN: isang numero ng integridad ng RNA para sa pagtatalaga ng mga halaga ng integridad sa mga sukat ng RNA.BMC Molecular Biol 7, 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】Gabay sa Gumagamit ng Oncomine Human Immune Repertoire (Pub. No. MAN0017438 Rev. C.0).

【3】Leah C Wehmas, Charles E Wood, Brian N Chorley, Carole L Yauk, Gail M Nelson, Susan D Hester, Mga Pinahusay na Sukatan ng Kalidad para sa Pagtatasa ng RNA na Hinango Mula sa Mga Sample ng Tissue na Naka-embed na Paraffin na Naka-embed na Archival, Toxicological Sciences, Volume 170, Issue 3, Agosto 3, Issue 3https://doi.org/10.1093/toxsci/