1. Paunang pag-unawa

Sa yugtong ito, kailangan nating maunawaan ang ilang mga konsepto at terminolohiya, upang maiwasang magkamali sa harap ng ating mga nakatatanda, tulad ng:

Q: Ano ang pagkakaiba ng RT-PCR, qPCR, Real-time PCR, at real-time na RT-PCR?

Sagot: Ang RT-PCR ay reverse transcription PCR(reverse transcription PCR, RT-PCR), na malawakang ginagamit na variant ng polymerase chain reaction (PCR).Sa RT-PCR, ang isang RNA strand ay reverse transcribe sa complementary DNA, na pagkatapos ay ginagamit bilang isang template para sa DNA amplification ng PCR.
Real-time-PCR at qPCR(Quantitative Rea-ltime-PCR) ay pareho, parehong real-time na quantitative PCR, na nangangahulugan na ang bawat cycle ng PCR ay may real-time na mga talaan ng data, kaya ang bilang ng mga panimulang template ay maaaring iakma sa tumpak na pagsusuri.

Bagama't ang parehong Real-time PCR (real-time fluorescent quantitative PCR) at Reverse transcription PCR (reverse transcription PCR) ay tila pinaikli bilang RT-PCR, ang internasyonal na kombensiyon ay: Ang RT-PCR ay partikular na tumutukoy sa reverse transcriptionPCR , Ang real-time na PCR ay karaniwang dinaglat bilang qPCR (quantitative real-time PCR).

At real-time na RT-PCR (RT-qPCR), Ito ang reverse transcription PCR na sinamahan ng fluorescent quantitative na teknolohiya: kumuha muna ng cDNA (RT) mula sa RNA reverse transcription, at pagkatapos ay gumamit ng Real-time PCR para sa quantitative analysis (qPCR).Karamihan sa mga laboratoryo ay gumagawa ng RT-qPCR, iyon ay, pagsasaliksik sa RNA expression down-regulation, kaya ang qPCR na pinag-uusapan ng lahat sa laboratoryo ay talagang tumutukoy sa RT-qPCR, ngunit huwag kalimutan na mayroon pa ring maraming mga pagsusuri sa DNA sa mga klinikal na aplikasyon.Pagsusuri ng dami, tulad ng pagtukoy sa hepatitis B virus HBV.

Tanong: Pagkatapos magbasa ng maraming fluorescent quantitative PCR, bakit dapat kontrolin ang amplified fragment sa loob ng hanay na 80-300bp?

Sagot: Ang haba ng bawat sequence ng gene ay iba, ang ilan ay ilang kb, ang ilan ay daan-daang bp, ngunit kailangan lang nating hilingin ang haba ng produkto na 80-300bp kapag nagdidisenyo ng mga primer, masyadong maikli o masyadong mahaba ay hindi angkop para sa fluorescent quantitative PCR detection .Ang fragment ng produkto ay masyadong maikli upang makilala mula sa primer-dimer.Ang haba ng primer-dimer ay humigit-kumulang 30-40bp, at mahirap matukoy kung ito ay isang primer-dimer o isang produkto kung ito ay mas mababa sa 80bp.Kung ang fragment ng produkto ay masyadong mahaba, lampas sa 300bp, madali itong hahantong sa mababang kahusayan sa amplification at hindi epektibong matukoy ang dami ng gene.

Halimbawa, kapag binibilang mo kung gaano karaming tao ang nasa isang silid-aralan, kailangan mo lamang bilangin kung gaano karaming mga bibig ang mayroon.Ang parehong ay totoo kapag na-detect mo ang mga gene, kailangan mo lamang na makita ang isang tiyak na pagkakasunud-sunod ng isang gene upang kumatawan Ang buong sequence ay gagawin.Kung gusto mong magbilang ng mga tao, kailangan mong bilangin ang parehong bibig at ilong, tainga, at salamin, at madaling magkamali.

Upang palawakin, sa biological na pananaliksik, maraming mga kaso ng pananaliksik mula sa isang lugar hanggang sa lugar, dahil ang pagkakasunud-sunod ng gene ng anumang mga species ay napakahaba, ito ay hindi kailangan at imposibleng sukatin ang lahat ng mga fragment, tulad ng bacterial 16S sequencing, na kung saan ay upang isakatuparan ang konserbatibong pagkakasunud-sunod ng mga bacteria Assays upang mahinuha ang bilang ng isang tiyak na populasyon ng bakterya.

Q: Ano ang pinakamainam na haba para sa qPCR primer na disenyo?

Sagot: Sa pangkalahatan, ang haba ng primer ay mga 20-24bp, na mas mabuti.Siyempre, dapat nating bigyang-pansin ang halaga ng TM ng panimulang aklat kapag nagdidisenyo ng panimulang aklat, dahil ito ay nauugnay sa pinakamainam na temperatura ng pagsusubo.Pagkatapos ng maraming eksperimento, napatunayan na ang 60°C ay isang mas magandang halaga ng TM.Kung ang temperatura ng pagsusubo ay masyadong mababa, madali itong humantong sa hindi tiyak na amplification.Kung ang temperatura ng pagsusubo ay masyadong mataas, ang kahusayan ng amplification ay medyo mababa, ang rurok ng amplification curve ay magsisimula sa ibang pagkakataon, at ang halaga ng CT ay maaantala.

T: Paano naiiba ang paraan ng pangkulay sa pamamaraan ng pagsisiyasat?

Sagot: Paraan ng pangkulayAng ilang mga fluorescent dyes, tulad ng SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, atbp., ay hindi naglalabas ng liwanag nang mag-isa, ngunit maglalabas ng fluorescence pagkatapos mag-binding sa minor groove ng double-stranded DNA.Samakatuwid, sa simula ng reaksyon ng PCR, hindi matukoy ng makina ang fluorescent signal.Kapag ang reaksyon ay umabot sa yugto ng annealing-extension, ang double strand ay binuksan, at isang bagong strand ay synthesize sa ilalim ng pagkilos ng DNA polymerase, at ang fluorescent molecule ay nagbubuklod sa dsDNA minor groove.Habang tumataas ang bilang ng mga cycle ng PCR, parami nang parami ang mga tina ay pinagsama sa double-stranded na DNA, at ang fluorescent signal ay patuloy ding pinahusay.Ang pamamaraang pangkulay ay pangunahing ginagamit sa siyentipikong pananaliksik.
PS: Mag-ingat sa paggawa ng eksperimento, ang dye ay kailangang isama sa DNA ng tao, mag-ingat upang maging fluorescent na tao.

Paraan ng dye (kaliwa) Paraan ng Probe (kanan)
PS: Mag-ingat sa paggawa ng eksperimento, ang dye ay kailangang isama sa DNA ng tao, mag-ingat upang maging fluorescent na tao.

Ang SYBR Green Ⅰ ay nagbubuklod sa minor groove ng DNA

Paraan ng pagsisiyasatAng Taqman probe ay ang pinakakaraniwang ginagamit na hydrolysis probe.Mayroong isang fluorescent group sa 5′ dulo ng probe, kadalasang FAM, at ang probe mismo ay isang sequence na pantulong sa target na gene.Mayroong fluorescent quenching group sa 3′ dulo.Ayon sa prinsipyo ng paglipat ng enerhiya ng fluorescence resonance (Förster resonance energy transfer, FRET), kapag ang reporter fluorescent group (donor fluorescent molecule) at ang quenching fluorescent group (acceptor fluorescent molecule) ay nasasabik kapag ang overlap ng spectra at ang distansya ay napakalapit (7-10NM), ang paggulo ng donor ay maaaring mapukaw ang fluorescence ng pagtanggap ng molekula, ang pag-aakma ng autofluorcescence ay ang pag-aaksaya ng pagtanggap ng pag-alis ng mga tanggap na pag-aaksaya, ang pag-alis ng mga molekulang pag-alis ng hair na ang pagtanggap ng molekonyo, mahina.Samakatuwid, sa simula ng reaksyon ng PCR, kapag ang probe ay libre at buo sa system, ang reporter fluorescent group ay hindi maglalabas ng fluorescence.Kapag ang pagsusubo, ang panimulang aklat at probe ay nagbubuklod sa template.Sa yugto ng extension, ang polymerase ay patuloy na nag-synthesize ng mga bagong chain.Ang DNA polymerase ay may 5′-3′ exonuclease na aktibidad.Kapag naabot ang probe, i-hydrolyze ng DNA polymerase ang probe mula sa template, ihihiwalay ang reporter fluorescent group mula sa quencher fluorescent group, at ilalabas ang fluorescent signal.Dahil may one-to-one na relasyon sa pagitan ng probe at template, ang probe method ay mas mataas kaysa sa dye method sa mga tuntunin ng katumpakan at sensitivity ng pagsubok.Ang pamamaraan ng pagsisiyasat ay pangunahing ginagamit sa pagsusuri.

Q: Ano ang absolute quantification?Ano ang Relative Quantification?

Sagot: Ang absolute quantification ay tumutukoy sa pagkalkula ng paunang numero ng kopya ng sample na susuriin ng qPCR, gaya ng kung ilang HBV virus ang nasa 1ml ng dugo.Ang resulta na nakuha ng relatibong quantification ay ang pagbabago sa dami ng target na gene sa isang partikular na sample na nauugnay sa isa pang sample na sanggunian, at ang expression ng gene ay up-regulated o down-regulated.

T: Makakaapekto ba ang dami ng RNA extraction, reverse transcription efficiency, at amplification efficiency sa mga eksperimentong resulta?
T: Makakaapekto ba ang sample storage, extraction reagents, reverse transcription reagents, at light-transmitting consumable sa mga eksperimentong resulta?
T: Anong paraan ang maaaring itama ang pang-eksperimentong data?

Tungkol sa mga isyung ito, ilalarawan namin ang mga ito nang detalyado sa mga advanced at advanced na seksyon sa ibaba.
2. Maunlad na kaalaman

Sa pagsasaalang-alang sa real-time na fluorescent quantitative PCR, dapat nating kilalanin ang katotohanan na libu-libong mga siyentipikong papel sa pananaliksik ang nai-publish bawat taon, kung saan ang fluorescent quantitative PCR na teknolohiya ay hindi isang maliit na bilang.

Kung walang karaniwang pamantayan para sukatin ang fluorescent quantitative na eksperimento sa PCR, maaaring mag-iba nang malaki ang mga resulta.Para sa parehong gene ng parehong species, na may parehong paraan ng pagpoproseso, ang mga resulta ng pagtuklas ay mag-iiba-iba rin nang malawak, at magiging mahirap para sa mga latecomer na ulitin ang parehong mga resulta.Ikaw Walang nakakaalam kung alin ang tama at alin ang mali.

Nangangahulugan ba ito na ang fluorescent quantitative PCR ay isang cheat technology o isang hindi mapagkakatiwalaang teknolohiya?Hindi, ito ay dahil ang fluorescent quantitative PCR ay mas sensitibo at mas tumpak, at ang isang maliit na maling operasyon ay magbubunga ng ganap na kabaligtaran na mga resulta.Ang isang maliit na pagkawala ay isang libong milya ang layo.Ang may-akda ng artikulo ay maaaring paulit-ulit na pahirapan ng mga tagasuri.Kasabay nito, ang mga tagasuri ng journal ay mahirap ding pumili mula sa iba't ibang mga eksperimentong resulta.

Sa kabuuan, tumuturo sa isang kakulangan ng pinagkasunduan sa real-time na mga eksperimento sa PCR.Sa layuning ito, ang mga senior scientist sa industriya ay nagsimulang magbalangkas ng mga pamantayan,na nangangailangan ng mga kontribyutor na magbigay ng ilang kinakailangang pang-eksperimentong at mga detalye sa pagpoproseso ng data (kabilang ang kinakailangang data) sa artikulo upang matugunan ang mga pamantayang ito .

Maaaring hatulan ng mga tagasuri ang kalidad ng eksperimento sa pamamagitan ng pagbabasa ng mga detalyeng ito;Magagamit din ito ng mga susunod na mambabasa para ulitin ang eksperimento o pagbutihin ang eksperimento.Pagkatapos ang mga resultang pang-eksperimentong nakuha sa ganitong paraan ay puno ng impormasyon, mataas na kalidad, at magagamit.

MIBBI (Minimum na Impormasyon para sa Biological at Biomedical Investigations -http://www.mibbi.org) ay nabuo.Ang MIBBI ay isang proyekto na nagbibigay ng mga pamantayan para sa mga eksperimento.Ito ay nai-publish sa kalikasan.Ang proyektong ito ay naglalayong sa iba't ibang biological na eksperimento, kabilang ang cell biology, Microarray, qPCR na ating tatalakayin ngayon, atbp., at ibinibigay para sa bawat uri ng eksperimento kapag nagsusumite ng mga manuskrito.Ang impormasyong iyon ay dapat ibigay sa lahat ng oras.

Sa proyekto ng MIBBI, mayroong dalawang artikulo na nauugnay sa fluorescent quantitative PCR, ibig sabihin:
·RDML (Real-Time PCR Data Markup Language) – isang structured na wika at gabay sa pag-uulat para sa real-time na quantitative PCR data;
·MIQE (Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments) – pinakamababang impormasyon para sa pag-publish ng mga artikulo tungkol sa real-time quantitative PCR experiments.
Una, pag-usapan natin ang tungkol sa RDML, ang detalye ng terminolohiya.

Kung walang standard definition para sa lahat, imposibleng ipagpatuloy ang talakayan, kaya naman napakahalaga ng paliwanag ng mga termino sa pagsusulit.
Kasama sa terminolohiya na ginamit sa fluorescent quantitative PCR experiment ang sumusunod na content.Ginawa ng QIAGEN ang pinakamahusay na buod para sa amin.Ang mga sumusunod ay tuyo lahatmga kalakal .

Curve ng amplification
Ang amplification curve ay tumutukoy sa curve na ginawa sa panahon ng proseso ng PCR, na may cycle number bilang abscissa at ang real-time na fluorescence intensity sa panahon ng reaksyon bilang ordinate.

Ang isang mahusay na curve ng amplification ay dapat magkaroon ng mga sumusunod na katangian: ang baseline ay flat o bahagyang nabawasan, at walang halatang pataas na trend;ang inflection point ng curve ay malinaw, at ang slope ng exponential phase ay proporsyonal sa kahusayan ng amplification.Kung mas malaki ang slope, mas mataas ang kahusayan ng amplification;ang pangkalahatang amplification curve Ang parallelism ay mabuti, na nagpapahiwatig na ang kahusayan ng amplification ng bawat tubo ay magkatulad;kitang-kita ang exponential phase ng amplification curve ng mga sample na mababa ang konsentrasyon.

Baseline (Baseline)
Ang baseline ay ang antas ng ingay ng maagang cycle, kadalasang sinusukat sa pagitan ng ika-3 at ika-15 na ikot, dahil ang pagtaas ng halaga ng fluorescence na dulot ng produkto ng amplification ay hindi matukoy sa panahong ito.Ang bilang ng mga cycle na ginamit upang kalkulahin ang baseline ay maaaring iba-iba at maaaring kailanganin na bawasan kung mataas na halaga ng template ang ginagamit o kung ang antas ng expression ng target na gene ay mataas.

Ang pagtatakda ng baseline ay nangangailangan ng pagtingin sa fluorescence data mula sa linearity amplification curve .Ang baseline ay itinakda upang ang paglaki ng amplification curve ay magsimula sa isang cycle number na mas malaki kaysa sa baseline cycle top number.Ang mga baseline ay kailangang itakda nang isa-isa para sa bawat target na sequence.Ang average na mga halaga ng fluorescence na nakita sa mga maagang cycle ay kailangang ibawas mula sa mga halaga ng fluorescence na nakuha sa mga amplified na produkto.Ang pinakabagong mga bersyon ng iba't ibang Real-Time PCR software ay nagbibigay-daan sa awtomatikong pag-optimize ng mga setting ng baseline para sa mga indibidwal na sample.

Sa mga unang ilang cycle ng PCR amplification reaction, hindi gaanong nagbabago ang fluorescence signal.Ang paglapit sa isang tuwid na linya ay tinatawag na baseline, ngunit kung titingnan nating mabuti ang unang ilang mga cycle, makikita natin na sa loob ng baseline ay kung ano ang nangyayari sa larawan sa ibaba.

Background Background ay tumutukoy sa
ang di-tiyak na halaga ng fluorescence sa reaksyon .Halimbawa: inefficient fluorescence quenching;o isang malaking bilang ng mga double-stranded na template ng DNA dahil sa paggamit ng SYBR Green.Ang mga bahagi ng background ng signal ay mathematically inalis ng Real-Time PCR software algorithm.

Signal ng reporter
Ang signal ng reporter ay tumutukoy sa fluorescent signal na nabuo ng SYBR Green o fluorescently na may label na sequence-specific na probe sa panahon ng Real-Time PCR.

Normalized Reporter Signal (RN)
Ang RN ay tumutukoy sa fluorescence intensity ng reporter dye na hinati sa fluorescence intensity ng passive reference dye na sinusukat sa bawat cycle.

Passive Reference Dye
Sa ilang Real-Time na PCR,ang fluorescent dye ROX ay ginagamit bilang panloob na sanggunian upang gawing normal ang fluorescent signal.Nagtatama ito para sa mga variation dahil sa hindi tumpak na pipetting, well position, at fluorescence fluctuations sa well-by-well na batayan.

Ang fluorescence threshold (threshold)
ay naayos sa itaas ng background na halaga at makabuluhang mas mababa sa talampas na halaga ng amplification curve.Dapat itong nasa linear na rehiyon ng amplification curve, na kumakatawan sa log-linear na hanay ng PCR detection.Ang mga threshold ay dapat itakda sa log-amplification curve view upang ang log-linear phase ng PCR ay madaling matukoy.Kung maraming target na gene sa Real-Time PCR, dapat itakda ang threshold para sa bawat target .Sa pangkalahatan, ang fluorescence signal ng unang 15 cycle ng PCR reaction ay ginagamit bilang fluorescence background signal, at ang fluorescence threshold ay 10 beses ang standard deviation ng fluorescence signal ng unang 3 hanggang 15 cycle ng PCR, at ang fluorescence threshold ay nakatakda sa exponential phase ng PCR amplification.Sa pangkalahatan, ang bawat instrumento ay may itinakda nitong fluorescence threshold bago gamitin.

Cycle Threshold (CT) o Crossing Point (CP)
Ang cycle kung saan ang amplification curve ay tumatawid sa threshold (ibig sabihin, ang punto kung saan ang pag-detect ng fluorescence ay tumataas nang malaki).Ang CT ay maaaring isang fraction at ang halaga ng panimulang template ay maaaring kalkulahin.Ang halaga ng CT ay kumakatawan sa bilang ng mga cycle na naranasan kapag ang fluorescent signal sa bawat PCR reaction tube ay umabot sa itinakdang threshold.Mayroong linear na ugnayan sa pagitan ng CT value ng bawat template at ang logarithm ng unang numero ng kopya ng template, angmas mataas ang unang numero ng kopya, mas maliit ang halaga ng CT, at kabaliktaran.Ang isang karaniwang kurba ay maaaring gawin sa pamamagitan ng paggamit ng isang pamantayan na may kilalang numero ng paunang kopya, kung saan ang abscissa ay kumakatawan sa halaga ng CT, at ang ordinate ay kumakatawan sa logarithm ng unang numero ng kopya.Samakatuwid, hangga't nakuha ang halaga ng CT ng hindi kilalang sample, ang unang numero ng kopya ng sample ay maaaring kalkulahin mula sa karaniwang curve.

ΔCT na halaga
Inilalarawan ang halaga ng ΔCTang pagkakaiba sa pagitan ng target na gene at ang katumbas na endogenous reference gene CT na halaga, gaya ng housekeeping gene, at ginagamit para gawing normal ang dami ng template na ginamit:
⇒ΔCT = CT (target gene) – CT (endogenous reference gene)

Halaga ng ΔΔCT
Inilalarawan ng ΔΔCT value ang pagkakaiba sa pagitan ng mean ΔΔCT value ng isang sample ng interes (hal, stimulated cells) at ang mean ΔΔCT value ng isang reference sample (hal, unstimulated cells).Ang reference sample ay tinatawag ding calibration sample at lahat ng iba pang sample ay na-normalize dito para sa relative quantification:
⇒ΔΔCT = average na ΔCT (sample ng interes) – average na ΔCT (reference sample)

Endogenous reference genes (endogenous reference genes)
Ang mga antas ng expression ng endogenous reference genes, gaya ng housekeeping genes (housekeeping genes), ay hindi naiiba sa pagitan ng mga sample.Ang paghahambing ng mga halaga ng CT ng reference gene sa target na gene ay nagbibigay-daan sa antas ng expression ng target na gene na ma-normalize sa dami ng input na RNA o cDNA (tingnan ang seksyon sa mga halaga ng ΔCT sa itaas).

Ang mga panloob na reference na gene ay tama para saposibleng pagkasira ng RNA o pagkakaroon ng mga enzyme inhibitor sa mga sample ng RNA, pati na rin ang mga pagkakaiba-iba sa nilalaman ng RNA, reverse transcription efficiency, pagbawi ng nucleic acid, at paghawak ng sample.Upang piliin ang (mga) pinakamainam na reference na gene, binago namin ang algorithm upang payagan ang pagpili nito ng pinakamainam na sanggunian na nakadepende sa pang-eksperimentong setting.

Panloob na kontrol
Isang control sequence na pinalaki sa parehong reaksyon gaya ng target na sequence at sinusuri gamit ang ibang probe (ibig sabihin, gumaganap ng duplex PCR).Ang mga panloob na kontrol ay kadalasang ginagamit upang ibukod ang mga nabigong amplification, gaya ng kapag hindi natukoy ang target na sequence.
Sample ng Calibration
Isang reference na sample (halimbawa, purified RNA mula sa isang cell line o tissue) na ginagamit sa relatibong quantification para ihambing ang lahat ng iba pang sample para matukoy ang relatibong antas ng expression ng isang gene.Ang sample ng pagkakalibrate ay maaaring maging anumang sample, ngunit kadalasan ay isang kontrol (halimbawa, isang hindi ginagamot na sample o isang sample mula sa time zero ng eksperimento).

Mga positibong kontrol
gumamit ng mga reaksyong kontrol na maykilalang halaga ng template.Ang mga positibong kontrol ay kadalasang ginagamit upang suriin kung ang isang primer set o primer-probe set ay gumagana nang maayos at ang reaksyon ay na-set up nang tama.

Walang Template Control (NTC)
Isang control reaction na naglalaman ng lahat ng kinakailangang bahagi ng amplification reaction maliban sa template, na kadalasang pinapalitan ng tubig.Ang paggamit ng NTC ay mahahanap ang kontaminasyon na dulot ng reagent contamination o dayuhang DNA, kaya tinitiyak ang pagiging tunay at pagiging maaasahan ng data ng pagtuklas.Ang pagpapalakas ng kontrol ng NTC ay nagpapahiwatig ng kontaminasyon.

Walang RT control (NRT)
Ang proseso ng pagkuha ng RNA ay maaaring maglaman ng natitirang genomic DNA, na lubhang nakakapinsala at ang salarin na nakakaapekto sa kalidad ng data at ang natural na kaaway ng qPCR, kaya kapag nagdidisenyo ng mga eksperimento, dapat itong idinisenyo upang palakasin lamang ang pagtuklas ng RNA.Mayroong dalawang paraan, ang isa ay ang pagdidisenyo ng mga panimulang aklat sa mga intron, ang isa naman ay ang ganap na pag-alis ng DNA, kung alin ang mas mahusay, na tatalakayin sa ibang pagkakataon.Ang kontrol ng NTR ay isang magic mirror upang makita ang polusyon ng DNA.Kung may amplification, ibig sabihin may polusyon.

Mga pamantayan
Ang mga pamantayan ay mga halimbawa ng kilalang konsentrasyon o numero ng kopya na ginagamit upang bumuo ng isang karaniwang kurba.Upang matiyak ang katatagan ng pamantayan, ang fragment ng gene ay karaniwang naka-clone sa plasmid at ginagamit bilang pamantayan.

Ang karaniwang kurba
ay karaniwang diluted sa hindi bababa sa 5 konsentrasyon gradients na may karaniwang produkto ayon sa pagdodoble ratio, at 5 puntos ay iguguhit sa mga coordinate ng CT halaga at numero ng kopya, at ang mga puntos ay konektado upang bumuo ng isang linya upang makabuo ng isang karaniwang curve.Para sa bawat karaniwang curve, kailangang suriin ang bisa nito.Ang halaga ng slope ay nasa pagitan ng -3.3 at -3.8, at ang bawat konsentrasyon ay ginagawa sa triplicate.Dapat itapon ang mga puntos na makabuluhang naiiba sa iba pang mga punto.Ang halaga ng CT ng sample na susuriin ay dinadala sa karaniwang kurba, at ang antas ng pagpapahayag ng sample na susuriin ay maaaring kalkulahin.

Ang halaga ng CT ng sample na susuriin ay dinadala sa karaniwang kurba, at ang paunang numero ng kopya ng sample na susuriin ay maaaring kalkulahin.

Kahusayan at Slope
Ang slope ng karaniwang curve ay kumakatawan sa kahusayan ng real-time na PCR.
· Ang slope na -3.322 ay nagpapahiwatig na ang kahusayan ng PCR amplification ay 1, o 100% na mahusay, at ang dami ng produkto ng PCR ay dumoble sa bawat cycle.
· Ang slope na mas mababa sa –3.322 (hal., –3.8) ay nagpapahiwatig ng kahusayan ng PCR
· Ang slope na mas malaki sa –3.322 (hal, –3.0) ay nagpapahiwatig na ang kahusayan ng PCR ay lumilitaw na higit sa 100%, na nakakapagtaka, paanong ang isang cycle ng PCR ay makabuo ng higit sa doble ng amplified na produkto?Ang sitwasyong ito ay nangyayari sa non-linear na yugto ng reaksyon ng PCR, iyon ay, mayroong isang malaking halaga ng hindi tiyak na amplification.

natutunaw na kurba
Matapos makumpleto ang qPCR amplification, ang produkto ng PCR ay pinainit.Habang tumataas ang temperatura, unti-unting natutunaw ang double-stranded amplification product, na nagreresulta sa pagbaba ng fluorescence intensity.Kapag naabot ang isang tiyak na temperatura (Tm), isang malaking bilang ng mga produkto ang matutunaw.Ang fluorescence ay bumaba nang husto.Ang iba't ibang mga produkto ng PCR ay may iba't ibang mga halaga ng Tm at iba't ibang temperatura ng pagkatunaw, upang matukoy ang pagtitiyak ng PCR.

Melting curve (derivative curve)
Ang melting curve ay hinango upang bumuo ng isang peak map, na maaaring mas madaling ipakita ang sitwasyon ng mga fragment ng produkto ng PCR.Dahil ang temperatura ng pagkatunaw ay ang halaga ng Tm ng fragment ng DNA, ang ilang mga parameter na nakakaapekto sa halaga ng Tm ng fragment ng DNA ay maaaring hatulan, tulad ng laki ng fragment, nilalaman ng GC, atbp. Sa pangkalahatan, ayon sa aming mga prinsipyo ng disenyo ng primer,ang haba ng amplified na produkto ay nasa hanay na 80-300bp, kaya ang temperatura ng pagkatunaw ay dapat nasa pagitan ng 80°C at 90°C.

Interpretasyon ng melting curve: Kung ang tanging pangunahing peak ay lilitaw sa pagitan ng 80°C-90°C, nangangahulugan ito na ang fluorescent quantitative PCR ay perpekto;kung ang pangunahing peak ay lalabas sa pagitan ng 80°C-90°C at ang iba't ibang peak ay lalabas sa ibaba 80°C, ang primer dimer ay karaniwang isinasaalang-alang.Maaari mong subukang taasan ang temperatura ng pagsusubo upang malutas ito;kung ang pangunahing peak ay lilitaw sa pagitan ng 80°C-90°C, at ang iba't ibang peak ay lilitaw muli kapag tumaas ang temperatura, ito ay karaniwang isinasaalang-alang na mayroong DNA contamination, at ang DNA ay kailangang alisin sa unang yugto ng eksperimento.

Siyempre, mayroon pa ring ilang mga hindi normal na sitwasyon, na isa-isa pang ibabahagi sa ibaba.
3. Maunlad na kaalaman

Upang gawin ang qPCR, kailangan kong sabihin ang MIQE,Minimum na Impormasyonpara sa Paglalathala ngDamiReal-Time na PCRMga Eksperimento —ang pinakamababang impormasyon para sa paglalathala ng mga artikulo tungkol sa real-time quantitative PCRmga eksperimento.Upang pasimplehin ang pang-unawa ng lahat, pasimplehin namin ang pangunahing nilalaman.

Maaari kang maghanap sa orihinal na teksto ng MIQE sa Internet, at ang pinakamahalagang bagay ay itinatakda nito angchecklist ng data na kailangang ibigay kapag naglalathala ng artikulo .

Maaaring hatulan ng mga tagasuri ang kalidad ng eksperimento sa pamamagitan ng pagbabasa ng mga detalyeng ito;magagamit din ito ng mga susunod na mambabasa para ulitin o pahusayin ang eksperimento.
Kapansin-pansin na sa listahang ito, ang kahalagahan ng bawat listahan ay minarkahan ng E o D ayon sa pagkakabanggit.Ano ang ibig sabihin nito?E: mahahalagang impormasyon (dapat isumite);D: kanais-nais na impormasyon (magbigay hangga't maaari).

MIQE (1)—Experimental na Disenyo
Maraming mga hamak na nakatapos ng kanilang depensa pagkatapos ng kanilang graduate na pag-aaral ay hindi alam kung paano magdisenyo ng isang eksperimento nang nakapag-iisa, buksan ang kanilang mga notebook, at gawin kung ano ang sinasabi ng guro sa kanila na gawin.Dahil dito, hindi mahigpit ang eksperimental na disenyo, at sinabi ng departamento ng editoryal ng magazine na gusto nilang buuin ang larawang ito at ang larawang iyon, kaya ginawa nila ito nang tulala.Ganito ginagawa ang mga hamak!

Mas malapit sa bahay, ang unang prinsipyo ng eksperimento ay upang matukoyang hirap ng experimental logic.Ang pinakapangunahing bagay ay ang pang-eksperimentong disenyo, at ang pinakamahalagang bagay tungkol sa pang-eksperimentong disenyo ay kung paano itakda ang target na sample, reference na sample (kontrol), at ang bilang ng mga pag-uulit, upang ang pang-eksperimentong data ay maisangguni, maihahambing, at kapani-paniwala.

Ang target na sampleay tumutukoy sa sample na nangangailangan sa amin na makita ang target na gene pagkatapos ng isang partikular na paggamot.Ang sample ng sanggunianay ang sample na walang anumang paggamot, na madalas na tinutukoy bilang wild type sa biology.

Mga pang-eksperimentong replikaay napakahalaga.Sa pangkalahatan, ang bilang ng mga mapanghikayat na replika ay dapat na higit sa tatlo.Kinakailangang makilala kung ano ang biological replication at ano ang technical replication.

Biological Replicates: Ang parehong eksperimento sa pag-verify na ginawa gamit ang iba't ibang materyales (oras, halaman, batch, reaction plate).

Biyolohikal na pagdoble
Kunin natin ang paggamot sa pestisidyo ng paminta bilang isang halimbawa.Gusto naming mag-spray ng mga pestisidyo sa tatlong halaman ng ABC, pagkatapos ay ang tatlong halaman ng ABC ay tatlong biological replicates, at ang mga ito ay ang parehong eksperimento sa pagpapatunay na isinagawa gamit ang iba't ibang mga materyales.Ngunit bilang isang eksperimento, tiyak na kailangan ang isang kontrol, upang maaari nating i-spray ang isa sa mga sanga ng halaman A upang bumuo ng isang pang-eksperimentong grupo ng halaman A, at hindi i-spray ang iba pang mga sanga ng halaman A upang bumuo ng isang control group.Gawin ang parehong para sa B at C.

Mga Teknikal na Replika (Mga Teknikal na Replika): Ito ay isang paulit-ulit na eksperimento na idinisenyo upang maiwasan ang mga error na dulot ng operasyon, na talagang isang duplicate na butas na kasama sa parehong materyal.Ang parehong mga paggamot at kontrol ay dapat na may mga replicate na setting (minimum na tatlo) ng target na gene at ang panloob na reference na gene.

Teknikal na pag-uulit
Kunin muli ang paminta na ginagamot sa mga pestisidyo.Para sa pang-eksperimentong pangkat ng halaman A, gumawa kami ng tatlong butas ng PCR na 1, 2, at 3 para sa target na gene nito at panloob na reference gene ayon sa pagkakabanggit, upang makuha ang average pagkatapos ng pagtuklas.Para sa kontrol ng halaman A Ang mga grupo ay ginagamot din sa parehong paraan.Katulad nito, gawin ang parehong paggamot para sa B at C na mga halaman.Ito ay teknikal na pag-uulit.

Ito ay nagkakahalaga ng pagpuna nakung ano ang pumapasok sa mga istatistika ay ang biological na pag-uulit, at ang teknikal na pag-uulit ay upang subukan kung mayroong anumang mga random na phenomena sa proseso ng eksperimentong, upang gawing kapani-paniwala ang mga resulta ng eksperimentong, iyon ay, upang maiwasan ang mga pagkakamali sa pamamagitan ng pagkuha ng kanilang average gaya ng madalas nating sinasabi.

Mga Negatibong Kontrol—NTC at NRT
NTC (No-Template Control), isang kontrol na walang template, ay ginagamit upang i-verify kung ang pang-eksperimentong materyal ay kontaminado.Sa pangkalahatan, ang tubig ay ginagamit bilang isang template.Kung mayroong isang fluorescent reaksyon, ito ay nagpapahiwatig na ang nucleic acid contamination ay naganap sa laboratoryo.

Ang mga polusyon na ito ay nagmumula sa: hindi malinis na tubig, hindi kwalipikadong mga reagents na naglalaman ng endogenous DNA, primer na polusyon, polusyon sa kagamitan sa laboratoryo, polusyon sa aerosol, atbp., kailangang gumamit ng RNase scavengers at RNase inhibitors.Ang polusyon sa aerosol ang pinakamahirap hanapin.Isipin na ang iyong laboratoryo ay tulad ng smog, na may iba't ibang mga nucleic acid na nasuspinde sa hangin.

NRT (No-Reverse Transcriptase), ang kontrol na walang reverse transcription, ay ang non-reverse na na-transcribe na RNA bilang negatibong kontrol, na siyang kontrol ng gDNA residue.

Kapag gumagawa ng gene expression, ang dami ng RNA ay natutukoy sa pamamagitan ng pag-detect ng dami ng cDNA pagkatapos ng reverse transcription.Kung mayroong nalalabi sa gDNA kapag na-purify ang RNA, magdudulot ito ng mga error sa mga resultang pang-eksperimento, dahil ang mga aktwal na resultang nakuha ay gDNA at cDNA.Sa pinagsama-samang antas, hindi lamang cDNA, ang gDNA ay kailangang ganap na alisin sa panahon ng pagkuha ng RNA.

MIQE (2)—sample na impormasyon
Ang tinatawag na sample na impormasyon ay nangangahulugan na kapag nag-publish kami ng isang artikulo tungkol sa qPCR, dapat naming ipaliwanag nang malinaw ang sample na impormasyon, na isang kailangang-kailangan na bahagi ng artikulo.Katulad nito, kapag nagproseso tayo ng mga sample, dapat din nating i-regulate ang sarili nating mga operasyon upang matiyak ang bisa ng mga sample.

Ang paglalarawan ng sample ay resulta lamang, at dapat nating bigyang pansin ang mga materyales na kinuha sa buong eksperimento.

Pagpili ng mga pang-eksperimentong materyales
Mga sample ng dugo – pumili ng sariwang dugo, hindi hihigit sa 4 na oras.Mga sample ng cell – piliin na mangolekta ng mga sariwang cell sa panahon ng masiglang paglaki.Animal Tissue—Pumili ng sariwa, masiglang lumalagong tissue.Plant Tissue – Pumili ng sariwa at batang tissue.

Napansin mo siguro na mayroong pangunahing salita sa ilang pangungusap na ito: sariwa .
Para sa mga sample sa itaas, ang pinakamahusay, cost-effective, at stable na kit sa merkado ay ang Foregene's kit, na mabilis at madaling makuha ang kanilang DNA at RNA.

Dugo DNA Mini Kit

Cell Total RNA Isolation Kit

Animal Total RNA Isolation Kit

Plant Total RNA Isolation Kit

Plant Total RNA Isolation Kit Plus

Plant DNA Isolation Kit

Imbakan ng mga pang-eksperimentong materyales
Sa pangkalahatan, hindi namin inirerekomenda ang pag-imbak ng mga sample, kung pinahihintulutan ng mga kondisyon.Gayunpaman, maraming mga kaibigan ang hindi maaaring magsagawa ng mga eksperimento kaagad pagkatapos ng sampling, at ang ilan ay kailangan pang magdala ng mga liquid nitrogen tank sa field para sa sampling.

Para sa ganitong uri ng masipag na kaibigan, masasabi ko lang na hindi mo naiintindihan ang mga reagent consumable.Ngayon maraming mga reagent consumable na kumpanya ang gumagawa ng mga reagents na maaaring mag-imbak ng mga sample ng RNA sa temperatura ng silid, at maaari mong piliing gamitin ang mga ito.Ang karaniwang paraan ng pag-iimbak ay ang pag-iimbak ng likidong nitrogen, gamit ang isang maliit na tangke ng likidong nitrogen na madaling dalhin.Pagkatapos ibalik ang sample sa laboratoryo, itabi ito sa isang -80°C na refrigerator.

Para sa mga eksperimento na kinasasangkutan ng RNA, dapat sundin ang anim na salita na prinsipyo:mababang temperatura, walang enzymes,atmabilis .

Ang konsepto ng mababang temperatura ay madaling maunawaan;Kung walang enzymes, ang RNase ay nasa lahat ng dako sa mundong ating ginagalawan (kung hindi ay napatay ka ng HIV), kaya kung paano maiwasan ang RNase kapag gumagawa ng mga eksperimento ay isang napakahalagang konsepto;mabilis,Walang Kung Fu sa mundo na hindi masisira, ang bilis lang ang hindi masisira.

Samakatuwid, sa isang kahulugan, mas maikli ang oras ng pagkuha, mas mahusay ang kit.Bakit ginagawaForegeneBinibigyang-diin ng kit ang bilis, dahil alam na alam nila ito.

PS: Ang ilang mga batang babae ay gumagawa ng mga eksperimento nang napakaingat, ngunit hindi sila kasinghusay ng isang slam dunk pagkatapos ng ilang taon ng trabaho.Pakiramdam nila ay hindi patas ang Diyos, nagrereklamo tungkol sa iba, at naghahanap ng buhay.Sa katunayan, hindi niya ito naiintindihan.Hindi niya naprotektahan ng mabuti ang RNA, at ang slam dunk player ay maliksi.Noong ginagawa niya ang eksperimento, naisip niyang tatapusin niya ang slam dunk ng tatlong beses, limang beses at dalawang dibisyon, ngunit nagawa niyang mabuti ang eksperimento.

Tandaan: Mas mabagal, mas maraming pagkakataon ng pagsalakay ng RNase.Paano sanayin ang iyong sarili upang maging mabilis?Walang paraan, magsanay pa.

Para sa iba't ibang mga eksperimento at iba't ibang mga sample, kailangan pa ring magbasa ng higit pang literatura at pumili ng angkop na paraan para sa pagproseso.Para sa sample na proseso ng pagkolekta at pag-iimbak, hinihiling ng MIQE na dapat itong malinaw na nakasulat sa papel, upang masuri ng mga reviewer ang pagiging maaasahan ng papel, at maginhawa rin para sa mga natulala na kabataan na ulitin ang iyong eksperimento.

Bagama't mahirap ang mga biological experiment, high-end ang mga ito.Kung hindi ka mag-iingat, maaari mong ibagsak ang mundo.Halimbawa, ang paggawa ng SARS sa isang biochemical crisis, o paggawa ng hybrid rice para iligtas ang 1.3 bilyong tao.Ang larawan sa ibaba ay isang eksperimento sa kemikal, dapat mong maunawaan kung gaano ka ipinagmamalaki ang iyong pananaliksik sa pamamagitan lamang ng pagtingin sa kanyang mukhang titi.Kalimutan ito, huwag itim siya.

MIQE (3) – pagkuha ng nucleic acid.
Ang pagkuha ng nucleic acid ay isang malaking kaganapan, at lahat ng mga eksperimento sa molecular biology ay nagsisimula sa pagkuha ng nucleic acid.Una sa lahat, kopyahin natin ang nilalaman ng MIQE sa pagkuha ng nucleic acid.

Sa pagtingin sa form na ito, hindi ka maaaring manatili sa ibabaw.Ang anyo ay isang dogma.Upang maging isang nangungunang mag-aaral, dapat mong itanong kung bakit.Ang mahahalagang nilalaman ng talahanayang ito ay: Ituloyang kadalisayan, integridad, pagkakapare-pareho, at dami ng pagkuha ng RNA .

Ang unang bahagi ngproseso o instrumento ang hakbang sa pagkuha ng nucleic acid.Kung gumagamit ka ng isang awtomatikong nucleic acid extractor upang i-extract (advanced, mangyaring makipag-ugnay sa akin para sa pagbili), kailangan mong ipahiwatig ang pangalan ng modelo ng instrumento.

Ang pangalan ng kit at

kung anong kit ang ginamit para sa mga detalye ng pagbabago, anong mga espesyal na reagents ang idinagdag o kung anong mga espesyal na operasyon ang ginawa ay dapat na ipaliwanag nang malinaw para madaling ulitin ng iba ang iyong eksperimento.

Ang ilang mga tao ay nagdaragdag ng ilang mga espesyal na reagents kapag kumukuha ng mga espesyal na sample, iniisip na ito ang kanilang lihim na sandata at huwag sabihin sa iba.Habang pinapanatili itong lihim, nawawalan din sila ng pagkakataong paningningin ang iyong artikulo.Huwag maging matalino, kailangan mong maging mas tapat kaysa sa matandang bansang Zhang sa siyentipikong pananaliksik, kung gusto mong maging matalino, gagawin kang tanga ng artikulo.

dapat tandaan ang numero ng produkto ng kitkapag nag-order ka ng kit at isulat ang artikulo.Sa pangkalahatan, mayroong dalawang numero sa kit: Cat—catalog number (numero ng produkto, numero ng artikulo), Lot—numero ng lot ng produkto ( Ginagamit upang isaad kung saang batch nanggaling ang produkto).

Bilang karagdagan, ang numero ng CAS ay madalas na ginagamit kapag nag-order ng mga biochemical reagents, at sabay-sabay ko itong ipapasikat.Ang CAS number ay ang numerong ibinigay ng American Chemical Society sa bawat bagong kemikal na gamot.Sa pangkalahatan, tatlong numero ay konektado sa pamamagitan ng isang gitling.Numero ng CAS ni Rushui: 7732-18-5.Ang mga kemikal ay kadalasang mayroong maraming alias, ngunit ang numero ng CAS ay natatangi.Kapag nag-order ng gamot, maaari mong suriin muna ang CAS number nito.

Mas malapit sa tahanan, bakit kailangan nating ilarawan nang malinaw ang mga bagay na ito?Sa katunayan, ito rin ay upang suriin ang kalidad ng pagkuha ng RNA.Ang paggamit ng mga instrumento at kit ay gagawing mas pare-pareho ang pagkuha ng RNA.Ang sukat ng pagkuha ng mga ordinaryong laboratoryo ay hindi malaki, at maaari itong makuha gamit ang mga kit.

Ang mga detalye ng paggamot sa DNase o RNase
Ang mahalagang isyu ng fluorescent quantitative PCR ay upang maiwasan ang kontaminasyon ng DNA, at huwag mag-eksperimento kung mayroong kontaminasyon.Samakatuwid, kinakailangang sabihin ang prosesong ginamit mo sa pagproseso ng DNA, upang ipakita na ang DNA sa eksperimentong proseso ay ganap at ganap na naalis.kinakatawan ng isang schematic diagram.

Schematic diagram ng RNA at DNA
Sa pangkalahatan, ang paraan para sa pag-alis ng DNA ay ang paggamot sa RNA na may DNase pagkatapos ng pagkuha.Gayunpaman, ang mga ito ay medyo lumang mga pamamaraan.Ang mga komersyal na RNA extraction kit ay nakapag-alis ng DNA sa panahon ng proseso ng pagkuha nang hindi nagdaragdag ng DNase.Halimbawa, isang serye ng mga kit mula sa Foregene .

Tandaan: Ang pag-alis ng DNA sa panahon ng RNA extraction ay isang napakadelikadong double-edged sword, na magpapahaba sa oras ng operasyon ng RNA extraction at magpapataas ng panganib ng RNA degradation.Karaniwan, ito ay isang trade-off sa pagitan ng ani ng RNA at kadalisayan.

Bilang karagdagan, ang dami ng DNase na idinagdag sa silica-based na adsorption column ay napakaliit, at ang mataas na kalidad na DNase ay dapat gamitin upang makamit ang epekto.Ang hindi na-optimize na DNase ay hindi maaaring matunaw nang mabilis at ganap.Ito ay isang pagsubok ng teknikal na antas ng merchant.Siyempre, may mas kakaibang mga mangangalakal na nagyayabang na ang DNA ay maaaring tanggalin nang walang DNase.Masasabing hooligan ang sinumang nagyayabang na ganap na maalis ang DNA nang walang DNase.Ang DNA ay isang medyo matatag na double-stranded na istraktura, at hindi ito mapapawi sa pamamagitan lamang ng pakikipag-usap at pagtawa.

Pagtatasa ng kontaminasyon
paraan ng pagtatasa: electrophoresis detection, 1% agarose, 6V/cm, 15min, loading 1-3 ul

Nucleic acid quantitative analysis
ay karaniwang sinusukat gamit ang isang UV spectrophotometer.Hayaan mo muna akong gawing popular ang kahulugan ng tatlong value ng OD260, OD280, at OD230.
·OD260nm: Ito ay ang absorption wavelength ng pinakamataas na absorption peak ng nucleic acid, at ang pinakamahusay na sinusukat na halaga ay mula 0.1 hanggang 1.0.Kung hindi, palabnawin o i-concentrate ang sample upang dalhin ito sa loob ng saklaw.
·OD280nm: Ito ay ang absorption wavelength ng pinakamataas na absorption peak ng protina at phenolic substance.
·OD230nm: Ito ay ang absorption wavelength ng pinakamataas na absorption peak ng carbohydrates.

Susunod, pag-usapan natin ang papel ng bawat tagapagpahiwatig.Para sa A260, maaari itong gamitin upang sukatin ang ani ng nucleic acid.Kapag OD260=1, dsDNA=50μg/ml, ssDNA=37μg/ml, RNA=40μg/ml.

Para sa kadalisayan, kailangan nating tingnan ang mga ratio na karaniwan nating nakikita: OD260/280 at OD260/230.
·Purong DNA: Ang OD260/280 ay tinatayang katumbas ng 1.8.Kapag ito ay higit sa 1.9, ito ay nagpapahiwatig na mayroong RNA pollution, at kapag ito ay mas mababa sa 1.6, ito ay nagpapahiwatig na mayroong protina at phenol pollution.
· Purong RNA: 1.7
·OD260/230: DNA man o RNA, ang reference na halaga ay 2.5.Kapag ito ay mas mababa sa 2.0, ito ay nagpapahiwatig na mayroong polusyon ng asukal, asin at organikong bagay.

Integridad ng RNA

Napakahalaga na sukatin ang integridad ng RNA.Sa pangkalahatan, kinakailangang gumawa ng eksperimento ng RNA denaturation gel upang masuri kung ang liwanag sa pagitan ng 28S at 18S RNA ay dalawang-tiklop na relasyon.Kapag lumitaw ang ikatlong banda na 5S, nangangahulugan ito na ang RNA ay nagsimulang bumaba, maliban sa mga invertebrate.

Data para sa pagtatasa ng kalidad ng RNA: Bilang karagdagan sa mga pagsubok sa itaas, mayroon ding ilang mas advanced na mga pagsubok sa instrumento sa mga tuntunin ng integridad ng RNA, tulad ng pagsubok sa integridad ng RQI ng sistema ng awtomatikong electrophoresis ng Experion, na maaaring makakita kung ang RNA ay hindi nakikita nang hindi nakikita.

Sa siyentipikong pananaliksik, ang fluorescent quantitative PCR ay isang paghahambing sa pagitan ng target na gene at ng panloob na reference gene.Samakatuwid, sa proseso ng pangangalaga ng sample ng RNA, pagkuha ng RNA, atbp., ang pangunahing layunin ay upang matiyak ang integridad ng RNA .

Kung paano naaapektuhan ng integridad ng RNA ang balanse sa pagitan ng target na gene at ng panloob na reference gene ay madaling maunawaan mula sa figure sa ibaba.Ang pagkasira ay hahantong sa hindi pagkakumpleto ng gene, kung ito man ay ang hindi kumpleto ng panloob na reference gene o ang hindi pagkakumpleto ng target na gene, ito ay magkakaroon ng malaking epekto sa data.

Schematic diagram ng target gene at reference gene, ay hindi dapat totoo

Pagsusuri sa pagsugpo (kung ang halaga ng CT ay pinigilan sa ilalim ng mataas o mababang konsentrasyon o iba pang mga kundisyon)

Ang pagkuha sa figure na ito bilang isang halimbawa, ang mga halaga ng Ct ng limang kurba ay ang mga sumusunod.Ang pamamahagi ng mga halaga ng CT sa pagitan ng mga kurba ay hindi pantay, at ang mga halaga ng Ct ay naantala sa ilalim ng mataas at mababang konsentrasyon, na siyang kaso ng pagsugpo sa PCR.

Pangunahing punto: Sa proseso ng pagkuha ng RNA, kailangan nating iwanan ang mga maling akala at magtatag ng mga tama.

Ang maling ideya ay: Ang RNA extraction ay hinahabol lamang ang ani, iniisip na mas malaki ang halaga ng RNA na nakuha, mas mabuti.Sa katunayan, kapag gumawa kami ng quantification, kung ang bilang ng mga gene ay hindi masyadong malaki, hindi namin kailangan ng maraming RNA.Ang dami ng RNA na iyong na-extract ay higit pa sa sapat.

Ang tamang konsepto ay:Ang pagkuha ng RNA ay dapat ituloy ang kadalisayan, integridad at pagkakapare-pareho.Maaaring tiyakin ng kadalisayan na ang kasunod na reverse transcription ay hindi mapipigilan at ang data ay hindi maaapektuhan ng DNA.Tinitiyak ng integridad ang balanse ng mga target na pagkakasunud-sunod at panloob na sanggunian.Tinitiyak ng pagkakapare-pareho ang matatag na pag-load ng sample.

MIQE (4) – reverse transcription
Maling akala: ang pagtugis ng mas mataas na dami ng sample.
Tamang konsepto: Ituloy ang pagkakapare-pareho (stability), anuman ang dami ng RNA na na-load, ang kahusayan ng reverse transcription ay nananatiling pare-pareho, na tinitiyak na ang mga pagkakaiba sa cDNA ay maaaring tunay na sumasalamin sa mga pagkakaiba sa mRNA.
Ipinapaliwanag namin ang prosesong ito gamit ang isang schematic diagram:

Schematic diagram ng reverse transcription efficiency, hindi totoo
Una sa lahat, kailangan nating maunawaan ang pagkakaiba sa pagitan ng reverse transcription process at PCR process.Ang PCR ay sumasailalim sa maramihang mga proseso ng pag-init at pagsusubo, at ang target na fragment ay lumalaki nang husto;habang ang reverse transcription ay walang ganitong proseso, maaari nating isipin na ang reverse transcription ay isa-sa-isa Sa panahon ng proseso ng pagtitiklop, kasing dami ng piraso ng RNA

dahil mayroong maaaring makakuha ng maraming piraso ng cDNA Information, dapat itong maunawaan sa ngayon, dahil ang mga fragment na malaki at maliit ay na-reverse-transcribe, at imposibleng tumuon sa isang fragment.At dahil ang halaga ng RNA ay medyo maliit, ang halaga ng cDNA na nakuha ay medyo maliit din, hindi katulad ng PCR, na may amplification effect, kaya ito ay karaniwang imposibleng matukoy.

Mga resulta ng electrophoresis ng cDNA
Pangalawa, sa isip, ang reverse transcription ay isa-sa-isa, ngunit walang reverse transcriptase mula sa anumang kumpanya ang makakamit ang epektong ito.Karaniwan, ang kahusayan ng karamihan sa mga reverse transcriptases ay gumagala sa pagitan ng 30-50%.Kung ito ang kaso, mas gugustuhin nating magkaroon ng medyo stable na reverse transcription efficiency, na gusto nating makita sa figure: 3 RNA ang nakakakuha ng 2 cDNA, 6 na RNA ang nakakakuha ng 4 na cDNA, kaya gaano man karami ang sample na na-load , medyo stable ang reverse transcription efficiency.Hindi namin gustong makita ang sitwasyon kung saan hindi matatag ang reverse transcription efficiency at pinipigilan ang mataas na konsentrasyon.

Kaya, paano i-verify kung ang reverse transcription na kahusayan ay matatag?Ang pamamaraan ay napaka-simple, kailangan mo lamang gawin ang isang pagsubok sa paghahambing: ang isa ay upang baligtarin ang pag-transcribe sa cDNA pagkatapos ng pagdodoble ng pagbabanto ng RNA, at ang isa pa ay ang pagdodoble ng pagbabanto pagkatapos ng reverse transcribe sa cDNA, at pagkatapos ay gawin ang qPCR upang makita ang nakuha na slope Ito ba ay pare-pareho.Bilang isang nangungunang mag-aaral, dapat mong maunawaan ito sa ilang segundo.Gaya ng ipinapakita sa ibaba:

Dilution ng RNA at cDNA upang masubukan kung ang kahusayan ng reverse transcription ay matatag
Baliktarin ang transcriptase at kit
Paano magkakaroon ng mahusay na reverse transcriptase at kit ang perpektong fluorescent quantitative PCR.Ang reverse transcriptase ay halos nahahati sa dalawang uri ayon sa pinagmulan, AMV oM-MLV, at ang kanilang pagganap ay kapareho ng ipinapakita sa talahanayan.

Aktibidad ng RNase H
Ang RNase H ay Ribonuclease H, ang Chinese na pangalan ay ribonuclease H, na isang endoribonuclease na maaaring partikular na mag-hydrolyze ng RNA sa DNA-RNA hybrid chain.Hindi maaaring i-hydrolyze ng RNase H ang mga phosphodiester bond sa single-stranded o double-stranded na DNA o RNA, iyon ay, hindi nito matunaw ang single-stranded o double-stranded na DNA o RNA.Karaniwang ginagamit sa synthesis ng pangalawang strand ng cDNA.

Ito ay isang kakaibang bagay.Sinasabi namin na ang reverse transcriptase ay may aktibidad na RNase H, hindi na ang reverse transcriptase ay naglalaman ng RNase H, at maaaring hindi posible na paghiwalayin ang RNase H mula sa reverse transcriptase, marahil dahil sa conformation ng ilang mga grupo sa reverse transcriptase Ang aktibidad na ito ay sanhi ng reverse transcriptase.

Samakatuwid, anuman ang mas mataas na reverse transcription efficiency ng AMV, binabawasan ng aktibidad ng RNase H nito ang ani ng cDNA.Siyempre, ang mga tagagawa ng reagent ay patuloy na nag-optimize ng kanilang mga produkto upang maalis ang aktibidad ng RNase H sa reverse transcriptase hangga't maaari upang mapataas ang ani ng cDNA.
Temperatura ng pagsusubo

Pangalawang istraktura ng RNA sa iba't ibang temperatura
Tingnan ang figure sa itaas para sa pangalawang istraktura ng RNA sa iba't ibang temperatura, at gamitin ang mFold online na tool upang matukoy ang pangalawang istraktura ng target na fragment sa ilalim ng partikular na temperatura at mga kondisyon ng konsentrasyon ng asin.Sa 55 ° C, ang pangalawang istraktura ng RNA ay napaka-kumplikado pa rin, ang reverse transcriptase ay hindi maaaring gumana, at ang pangalawang istraktura ay hindi maaaring ganap na malutas hanggang 65 ° C, habang ang pinakamainam na temperatura ng AMV at M-MLV ay mas mababa kaysa sa temperatura na ito.
anong gagawin?Ang pangalawang istraktura ay ang komplementaryong pagpapares ng template mismo, na humahantong sa matinding kumpetisyon sa pagitan ng primer at reverse transcriptase at ng template, na nagreresulta sa isang serye ng mga problema tulad ng mababang E at mahinang repeatability.

anong gagawin?Dagdagan lamang ang temperatura ng pagsusubo hangga't maaari.

Maraming mga tagagawa ng reagent ang pinapabuti ang kanilang reverse transcriptase sa pamamagitan ng genetic engineering.Ang ilan ay nagpapataas ng temperatura ng reaksyon, tulad ng Jifan at Aidelai, at ang ilan ay nag-aalis ng aktibong grupo ng RNase H enzyme upang mapabuti ang pagkakaugnay sa pagitan ng enzyme at ang template ng RNA.Ang mataas na affinity ay maaaring mapagkumpitensyang pisilin ang pangalawang istraktura at basahin nang maayos, at lubos ding mapabuti ang kahusayan ng reverse transcription.
Pangunahing punto: Ang reverse transcription ay mas mahalaga upang ituloy ang pagkakapare-pareho ng reverse transcription na kahusayan (ang mga enzyme ay dapat hindi lamang mahusay ngunit matatag din), sa halip na ang dami ng sample na na-load, kung ito ay hindi isang partikular na malakihang fluorescent quantitative PCR, hindi ito magiging posible sa lahat.Maramihang mga cDNA.
Ang iba't ibang mga tagagawa ay gumawa din ng ilang mga pagsisikap sa pagtugis ng pagkakapare-pareho.Halimbawa, karamihan sa mga kumpanya ay nag-package na ngayon ng reverse transcription bilang isang karaniwang kit para sa pagbebenta, na isang magandang pagpipilian.
Halimbawa, ang mga RT Easy Series kit ng Foregene:

RT Easy I(Master premix para sa first strand cDNA synthesis kit )

MIQE (5) – impormasyon ng target na gene

Ang figure sa itaas ay nagpapaliwanag
1. Kung mabisa ang gene na ito para sa mga paulit-ulit na eksperimento ay karaniwang mabe-verify sa pamamagitan ng paulit-ulit na mga eksperimento.
2. Gene ID, alam mo.
3. Haba ng gene, ang kabuuang haba ng target na gene ay tiyak na walang problema.Kapag nagdidisenyo ng mga panimulang aklat, tiyaking ang haba ng amplicon ay nasa pagitan ng 80-200bp upang matiyak ang mas mahusay na kahusayan sa amplification.
4. Sequence Blast paghahambing ng impormasyon, ang target na gene ay kailangang ikumpara sa genebank upang maiwasan ang hindi partikular na amplification.
5. Pagkakaroon ng pseudogenes.Ang pseudogene ay isang DNA sequence na katulad ng isang normal na gene ngunit nawawala ang normal na paggana nito.Madalas itong umiiral sa multi-gene na pamilya ng mga eukaryotes.Karaniwan itong kinakatawan ng ψ.Ito ay isang non-functional genomic DNA copy sa genome na halos kapareho sa coding gene sequence., ay karaniwang hindi na-transcribe, at walang malinaw na pisyolohikal na kahulugan.
6. Posisyon ng mga panimulang aklat na may kaugnayan sa mga exon at intron.Sa mga unang taon, kapag nalutas namin ang problema sa kontaminasyon ng DNA, madalas naming binibigyang pansin ang mga posisyon ng mga primer, exon, at intron, at sa pangkalahatan ay isinasaalang-alang ang pagdidisenyo ng mga panimulang aklat sa mga intron upang maiwasan ang pagpapalaki ng DNA.Pakitingnan ang figure sa ibaba: ang itim ay kumakatawan sa mga intron, ang iba't ibang blues ay kumakatawan sa mga exon, pink ay kumakatawan sa mga karaniwang panimulang aklat, at ang maliwanag na pula ay kumakatawan sa mga primer na sumasaklaw sa intron.

Schematic, hindi totoo
Mukhang isang perpektong plano ito, ngunit sa katunayan, sa karamihan ng mga kaso, ang mga trans-intron primer ay hindi kasing kabigha-bighani, at magdudulot din sila ng hindi partikular na amplification.Kaya ang pinakamahusay na paraan upang maiwasan ang kontaminasyon ng DNA ay ganap na alisin ang DNA.
7. Conformation prediction.Gamit ang halimbawang ito muli, gamitin ang mFold online na tool upang matukoy ang pangalawang istraktura ng target na fragment sa isang partikular na temperatura at konsentrasyon ng asin.

Pangalawang istraktura ng RNA sa iba't ibang temperatura
Ang pangalawang istraktura ay ang komplementaryong pagpapares ng template mismo, na hahantong sa malakas na kumpetisyon sa pagitan ng primer at template na pagpapares, at ang mga pagkakataon ng panimulang pagbubuklod ay mas mababa, na nagreresulta sa isang serye ng mga problema tulad ng mababang E at mahinang repeatability.Sa pamamagitan ng paghula ng software, kung walang pangalawang problema sa istraktura, iyon ay magiging mahusay.Kung mayroon, partikular na tatalakayin ng aming follow-up na artikulo kung paano lutasin ang problemang ito.

MIQE (6)—qPCR Oligonucleotides

Para sa fluorescent quantitative PCR, ang unang bagay na nahihirapan ka sa araw-araw ay ang pagkuha ng RNA, at ang pangalawang bagay ay maaaring ang panimulang disenyo.
Una sa lahat, sinusuri pa rin namin ang mga patakaran tungkol sa disenyo ng panimulang aklat ayon sa checklist ng MIQE.Napakasimple nito na maaaring tumawa ang mga hamak, at maaari nating tapusin ito sa isang pangungusap: alamin ang pagkakasunud-sunod at posisyon ng panimulang probe at ang paraan ng pagbabago.Para sa paraan ng pagdalisay ng panimulang aklat, ang synthesis ng primer ay napakamura sa kasalukuyan, ang qPCR ay karapat-dapat sa PAGE at higit sa mga pamamaraan ng paglilinis, at ang impormasyon ng instrumento ng synthesis ay hindi mahalaga.Maraming mga tao ang gumagawa ng mga panimulang aklat sa loob ng mga dekada at hindi alam na ang synthesizer ay ABI3900.
Tungkol sa mga prinsipyo ng disenyo ng panimulang aklat, hindi mo kailangang isaulo ang mga ito sa pamamagitan ng pag-uulit, dahil karamihan sa mga pangunahing disenyo ng software o mga online na tool ay maaaring makayanan ang mga problemang ito (inirerekomenda ang online tool na primer3.ut.ee/), at 99.999% ng primer na disenyo ay hindi ginagawa nang manu-mano.
Suriin lamang ang mga sumusunod na punto pagkatapos idisenyo ang mga panimulang aklat:
1. Design primers malapit sa 3′ end: Sa kaso ng paggamit ng oligo dT primers para sa cDNA first-strand synthesis, kung isasaalang-alang ang reverse transcription efficiency at RNA integrity, ang mga dinisenyong primer ay kailangang idisenyo malapit sa 3′ end para mapahusay ang amplification efficiency .Gumamit ng isang larawan upang ipaliwanag ang mga sumusunod (walang paraan upang maunawaan ito):

Bakit kailangang idisenyo ang mga panimulang aklat malapit sa dulong 3′, hindi ito dapat totoo
2. TM value: Ang Tm value ay nasa 55-65°C (dahil ang exonuclease activity ang pinakamataas sa 60°C), at ang GC content ay nasa 40%-60%.
3. BLAST: Upang maiwasan ang hindi partikular na amplification ng genome, dapat gamitin ang Blast para sa karagdagang pag-verify.

MIQE(7)—proseso ng qPCR

1. qPCR kit
Ayon sa mga kinakailangan ng MIQE, dapat nating malinaw na ilarawan ang kumpletong mga kondisyon ng reaksyon sa artikulo, kabilang ang pagsasaayos ng sistema ng reaksyon ng PCR, kung anong kit ang ginagamit, sino ang tagagawa, gaano kalaki ang sistema ng reaksyon, kung ang pamamaraan ng pangulay o ang paraan ng pagsisiyasat ay ginagamit, mga setting ng programa ng PCR.Tiyak na makikita ng mga beteranong driver na hangga't napili ang kit, ang impormasyon sa itaas ay karaniwang tinutukoy.
Sa kasalukuyan, ang paggawa at paggawa ng fluorescent quantitative PCR kit ay isang napaka-mature na teknolohiya.Hangga't hindi ka pipili ng napakasamang mga tagagawa, ang posibilidad ng mga problema ay hindi mataas, ngunit gusto pa rin naming ibahagi sa iyo ang ilang mga punto:
Hot-start na Taq enzyme:Ang pinakamahalagang bahagi ng PCR ay ang hot-start na Taq enzyme.Ang mga hot-start enzymes sa merkado ay karaniwang nahahati sa dalawang uri, ang isa ay isang chemically modified hot-start enzyme (maiisip mo ito bilang paraffin embedding), at ang isa ay Ay isang hot-start enzyme para sa pagbabago ng antibody (antigen-antibody binding).Ang pagbabago sa kemikal ay isang maagang paraan ng mainit na pagsisimula ng mga enzyme.Kapag naabot ang isang tiyak na temperatura, ilalabas ng enzyme ang aktibidad nito.Ang antibody-modified hot-start enzyme ay gumagamit ng mga biological na pamamaraan upang harangan ang aktibidad ng enzyme.Kapag naabot ang isang tiyak na temperatura, ang antibody ay made-denatured at hindi aktibo bilang isang protina, at ang aktibidad ng enzyme ay dadalhin sa paglalaro.

Gayunpaman, ano ang silbi nito?Ito ang kaso, ang aktibidad ng pagpapalabas ng mga enzyme na binago ng antibody ay mas mabilis kaysa sa mga enzyme na binago ng kemikal, kaya sa mga tuntunin ng pagiging sensitibo, ang mga enzyme na binago ng antibody ay may kaunting kalamangan, kaya't sa pangkalahatan ay walang mga enzyme na binago ng kemikal sa mga kit sa merkado.Kung mayroon, kung gayon ang teknolohiya ng tagagawa na ito ay natigil pa rin sa panahon ng milenyo.
Konsentrasyon ng Magnesium Ion:Ang konsentrasyon ng magnesium ion ay napakahalaga sa reaksyon ng PCR.Ang naaangkop na konsentrasyon ng magnesium ion ay maaaring magsulong ng pagpapalabas ng aktibidad ng Taq enzyme.Kung ang konsentrasyon ay masyadong mababa, ang aktibidad ng enzyme ay makabuluhang mababawasan;kung ang konsentrasyon ay masyadong mataas, ang enzyme-catalyzed non-specific amplification ay mapapahusay.Ang konsentrasyon ng mga magnesium ions ay makakaapekto rin sa pagsusubo ng mga panimulang aklat, ang temperatura ng pagkatunaw ng template at mga produkto ng PCR, sa gayon ay nakakaapekto sa ani ng mga amplified na fragment.Ang konsentrasyon ng mga magnesium ions ay karaniwang kinokontrol sa 25mM.Siyempre, para sa isang mahusay na kit, ang konsentrasyon ng mga magnesium ions ay dapat na mahusay na kontrolado.Ang ilang mga mangangalakal ay nagdaragdag ng isang magnesium ion chelating agent sa reagent, na maaaring makamit ang epekto ng awtomatikong pagsasaayos ng konsentrasyon ng magnesium ion.
Konsentrasyon ng fluorescent dye:Ang fluorescent dye, na siyang SYBR Green na kadalasang ginagamit namin, ay pangunahing bumubuo ng fluorescence sa pamamagitan ng pag-binding sa minor groove ng double-stranded DNA, dahil ang pag-binding ng dye sa double-stranded DNA ay hindi partikular, ibig sabihin, Hangga't ang double-stranded na DNA ay pinagsama dito, ang fluorescence ay maaaring mangyari sa isang background na template-dimer, kaya't ito ay magbubuo ng isang background na template-dimer ng DNA.
PS: Dahil sa light-sensitive na mga katangian nito, ang mga produkto sa merkado ay karaniwang nakabalot sa brown opaque centrifuge tubes (tulad ng ipinapakita sa larawan sa ibaba).Gayunpaman, makakatagpo ito ng problema.Mahirap makita kung ang likido ay sinipsip kapag nagsa-sample.Sa bagay na ito, ang Qingke talaga ang pinaka-user-friendly (tulad ng ipinapakita sa larawan sa ibaba), at ang transparent na tubo ay nakabalot sa isang opaque na tin bag.Pagkatapos ay ilagay ito sa isang bag ng lata, isinasaalang-alang ang kaginhawaan ng pag-iwas sa liwanag at sampling.Dapat mong piliin ang tamang numero ng produkto.Ang TSE204 ay isang napaka-epektibong pag-iral, na nagtutulak sa akin na magtanim ng damo.

Ang konsentrasyon ng fluorescent dye ay napakahalaga din.Kung ang konsentrasyon ay masyadong mababa, ang amplification curve ay hindi tataas sa huling yugto at hindi perpekto;kung ang konsentrasyon ay masyadong mataas, ito ay magdudulot ng pagkagambala sa ingay.Dahil ang fluorescent quantitative PCR ay pangunahing nakasalalay sa halaga ng CT, kung ang konsentrasyon ng fluorescent dye ay hindi nababagay nang maayos, ang mababang punto ay mas mahusay kaysa sa mataas na punto.Siyempre, ang naaangkop na konsentrasyon ng tina ay ang pinakamahusay.

ROX: Ang ROX dyes ay ginagamit upang itama ang well-to-well fluorescence signal error.Ang ilang mga tagagawa ng instrumento ay nangangailangan ng pagkakalibrate, habang ang iba ay hindi.Halimbawa, ang paggamit ng Real Time PCR amplification instrument ng Thermo Fisher Scientific ay karaniwang nangangailangan ng pagkakalibrate, kabilang ang 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus, atbp. Ang pangkalahatang mga tagubilin sa kit ay maglalarawan dito.
Ang qPCR Mix ng Foregene ay naglalaman din ng ROX dye, na maginhawa para sa paggamit sa iba't ibang mga modelo.

Real Time PCR Kit-Taqman

Mahina ang paggamot sa hydrogen bond: Ang paggamot sa mahina na mga bono ng hydrogen ay medyo teknikal na bagay.Walang nakabasa sa mga manual ng maraming kit, ngunit wala sa kanila ang nagbanggit ng paksang ito.Sa katunayan, ito ay napakahalaga.Ang kumbinasyon ng mga base ay pangunahing nakasalalay sa lakas ng mga bono ng hydrogen.Ang malakas na mga bono ng hydrogen ay normal na pagpapalakas, at ang mahinang mga bono ng hydrogen ay humahantong sa hindi tiyak na pagpapalakas.Kung ang mahinang mga bono ng hydrogen ay hindi maalis nang maayos, hindi maiiwasan ang hindi tiyak na pagpapalakas.Sa loob ng saklaw ng may-akda, ilang kumpanya lamang ang nakapansin sa problemang ito.Kapag binili mo ang kit, maaari kang sumangguni sa kung isinasaalang-alang mo ang isang solusyon sa bagay na ito para sa kit na gusto mong piliin.

Dami ng reaksyon: Ang 20-50ul system ay mas karaniwang ginagamit, at ang mas maliliit na volume ay malamang na magdulot ng mga error.Sa pangkalahatan, irerekomenda ng mga tagubilin sa kit ang paggamit ng dami ng reaksyon ng PCR.Huwag maging matalino at gumamit ng mas maliliit na volume upang makatipid ng mga gastos.ang layunin ng.Ang volume na inirerekomenda ng mga mangangalakal ay aktwal na nasubok, at maaaring hindi nila malutas ang problema ng mga error na dulot ng maliliit na volume.
2. Ang tagagawa at numero ng artikulo ng tube plate
Alam ng lahat ang prinsipyo ng fluorescent quantitative PCR.Ang pagkolekta ng fluorescence ay pangunahing isinasagawa sa pamamagitan ng mga takip ng tubo ng PCR.Kapag pumipili ng mga consumable ng PCR, bigyang-pansin ang dalawang punto: magandang paghahatid ng liwanag at angkop para sa instrumento.Sa pangkalahatan, maayos ang mga board at tube ng mga pangunahing tatak, ngunit kailangan mong maingat na pumili sa mga tuntunin ng pagbagay, kung hindi, hindi mo magagamit ang instrumento.

4. Nangungunang antas ng kaalaman

MIQE (8)—pag-validate ng qPCR
Ito ang pangunahing priyoridad ng qPCR!Napakaraming bayani ang nahulog sa buhangin dito.Syempre, posible rin na maswerte ka at simple lang ang genes na pinag-aralan mo, kaya lumutang ka sa ice cave sa kahabaan ng hangin.Ang impormasyon sa pag-verify ng qPCR ay inilaan upang subukan ang pagiging maaasahan ng data.Inilista namin ang kinakailangang impormasyon sa pag-verify tulad ng sumusunod:

1.Specificity test
Ang pagtitiyak ng target gene amplification ay nasubok sa pamamagitan ng pagsuri kung ang larawan ng electrophoresis ay isang solong banda;sequencing verification;melting curve upang makita kung ang peak map ay iisa;pag-verify ng pagtunaw ng enzyme at iba pang mga pamamaraan.
Dito, nakatuon kami sa tpagsusuri ng di-tiyak na pagpapalakas gamit ang paraan ng pagtunaw ng mga kurba.Sa pangkalahatan, kapag nagdidisenyo kami ng mga panimulang aklat, ang laki ng fragment ng produkto ay kinakailangang nasa hanay na 80-200bp, na ginagawang 80-85 °C ang temperatura ng pagkatunaw ng produkto ng PCR.Samakatuwid, kung mayroong iba't ibang mga taluktok, dapat mayroong iba pang hindi partikular na mga produkto ng amplification;kung ang peak ay lumilitaw sa ibaba 80°C, ito ay karaniwang itinuturing na isang primer dimer;kung ang peak ay lumalabas sa itaas 85°C, ito ay karaniwang itinuturing na DNA contamination o higit pang Nonspecific amplification ng malalaking fragment.
Tandaan: Minsan mayroon lamang isang peak sa 80°C.Sa panahong ito, dapat sundin ang konseptong ito.Malamang na ang mga resulta ng amplification ay ang lahat ng mga primer dimer.

Normal na melting curve (iisang peak na walang non-specific na amplification)

Problemadong melting curve (hindi partikular na amplification ng mga pekeng peak)
【Pagsusuri ng kaso】

Mayroong pangunahing rurok, ngunit ang primer dimer ay seryoso
Ang single-peak melting curve sa figure sa ibaba ay madaling linlangin ang iyong mga mata, sa pag-aakalang ito ay isang perpektong eksperimento, ngunit ang resulta ay ganap na mali.Sa oras na ito, kailangan nating tingnan ang temperatura ng pagkatunaw.Ang pinakamataas na temperatura ay mas mababa sa 80°C, na ganap na primer-dimer.

Walang target na fragment, lahat ng primer dimer
Eto, hindi mapigilan ng kapatid ko.Ang larawan sa ibaba ay isang larawang kuha gamit ang isang mobile phone na ipinadala sa akin ng isang hamak.Ang mga reagents na ginamit niya ay pawang mga karaniwang ginagamit na tatak sa industriya.Nagpalit siya mula sa isang T-prefix brand patungo sa isa pang T-prefix na brand.I think nahulaan mo na.Sumigaw sa akin ang scumbag: “Ang reagent na ginamit sa unang larawan ay napakaganda, at ang peak ay single.Mamaya, pagkatapos gamitin ang reagent na iyong inirerekumenda, ito ay magiging katulad ng pangalawang larawan, na may halo-halong mga taluktok.Ginawa mo akong miserable.“
Paghiwalayin ang dalawang graph.Sa unang sulyap, ang isa ay may isang solong rurok, at ang isa ay may dobleng rurok.Kalokohan, siyempre ayos lang ang isang solong peak.Totoo ba yan?
Mas malala pa kay Dou E, kung ilalagay ko ang dalawang larawan sa larawan sa ibaba, maiintindihan mo kaagad.Sa katunayan, madali tayong maparalisa sa ganitong uri ng larawan.Pagkatapos ng maingat na pagsusuri, nalaman namin na: ang peak ng unang figure ay nasa 75°C, na ganap na primer dimer;ang peak ng pangalawang figure ay lilitaw sa 75°C at 82°C, hindi bababa sa mayroong Lumilitaw ang produkto.

Mga larawan ng feedback mula sa mga mag-aaral
Kaya ang pangunahing problema ay hindi ang problema ng mga reagents, ngunit ang problema ng disenyo ng panimulang aklat.Kasabay nito, pinatutunayan din nito na ang ilang malalaking tatak ay hindi kalidad ng bakal, at pinatutunayan din nito ang sinabi ng aking kapatid na lalaki noon: Hindi ang tatak ng reagent ang sumusuporta sa iyong artikulo.Ang iyong artikulo ang nagpatibay sa tatak ng mga reagents.Isipin mo na lang, kung hindi binago ng scumbag ang mga reagents, maling data ang ipapadala sa journal, at ang mangyayari ay isang trahedya.
2. Ct value ng blangkong kontrol
Huwag ipaliwanag, kung ang blangkong kontrol ay may halaga ng Ct, hindi ba ito polusyon?Gayunpaman, kailangan mo pa ring maunawaan kung aling blangkong kontrol ang may Ct value.Kung NTC, ibig sabihin may foreign DNA gaya ng reagent contamination.Kung ito ay NRT, nangangahulugan ito na ang nakuhang RNA ay may kontaminasyon ng DNA.
3. Standard curve
Kasama ang slope at formula ng pagkalkula, ang kahusayan ng PCR ay maaaring kalkulahin sa pamamagitan ng formula.Ang isang perpektong eksperimento ay nangangailangan ng slope ng karaniwang kurba upang lapitan ang 3.32, at R² upang lapitan ang 0.9999.
4. Linear dynamic na hanay
Ang dynamic na hanay ng reaksyon ay linear.Ayon sa template na ginamit upang makabuo ng karaniwang curve, ang dynamic na hanay ay dapat magsama ng hindi bababa sa 5 mga gradient ng konsentrasyon, at bigyang pansin ang pagbabago ng mga halaga ng Ct sa mga gradient ng mataas na konsentrasyon at mga gradient ng mababang konsentrasyon.
5. Katumpakan ng pagtuklas
Ang mga pagbabago sa mga resulta ng qPCR, iyon ay, hindi magandang pag-uulit, iyon ay, hindi magandang katumpakan, ay sanhi ng maraming mga kadahilanan, kabilang ang temperatura, konsentrasyon, at operasyon.Ang katumpakan ng qPCR sa pangkalahatan ay nagiging hindi gaanong nakokontrol habang bumababa ang numero ng kopya.Pinakamainam na pagkakaiba-iba sa loob ng eksperimento, ang teknikal na pagkakaiba-iba na ito ay dapat na naiiba sa biyolohikal na pagkakaiba-iba, at ang mga biyolohikal na replika ay maaaring direktang matugunan ang mga pagkakaiba sa istatistika sa mga resulta ng qPCR sa pagitan ng mga grupo o paggamot.Sa partikular para sa mga diagnostic assay, dapat iulat ang pinakamahusay na inter-assay precision (repeatability) sa mga site at operator.
6. Episyente sa pagtuklas at LOD (sa multiplex qPCR)
Ang LOD ay ang pinakamababang konsentrasyon ng 95% ng mga positibong sample na nakita.Sa madaling salita, ang konsentrasyon ng LOD na nilalaman sa loob ng isang hanay ng mga target na gene replicates ay hindi dapat lumampas sa 5% ng mga nabigong reaksyon.Kapag gumagawa ng multiplex qPCR analysis, lalo na para sa sabay-sabay na pagtuklas ng mga point mutations o polymorphism, ang multiplex qPCR ay kailangang magbigay ng katibayan na ang katumpakan ng maramihang mga target na fragment ay hindi nakompromiso sa parehong tubo, maramihang pagtuklas at solong pagtuklas ng tubo Efficiency at LOD ay dapat na pareho.Lalo na kapag ang mga target na gene na may mataas na konsentrasyon at mga target na gene na mababa ang konsentrasyon ay sabay-sabay na pinalaki, dapat bigyang pansin ang problemang ito.
Mga problema at solusyonSa pangkalahatan, ang mga problemang madalas na nakakaharap sa pag-debug ng qPCR ay nakatuon sa mga sumusunod na aspeto:
· hindi tiyak na amplification
· Mahirap na pagpili ng panimulang konsentrasyon at problema sa mga primer-dimer
· Ang temperatura ng pagsusubo ay hindi tumpak
· Ang pangalawang istraktura ay nakakaapekto sa kahusayan ng amplification
nonspecific amplification
non-specific amplificationnangyayari , karaniwang isinasaalang-alang kung hindi angkop ang disenyo ng panimulang aklat, ngunit kung hindi ka nagmamadaling baguhin ang mga panimulang aklat, maaari mong subukan muna ang mga sumusunod na pamamaraan (nakalakip din ang prinsipyo):
·Taasan ang temperatura ng pagsusubo – subukang gawing hindi mapanatili ang mahinang hydrogen bond;
· Paikliin ang oras ng pagsusubo at pagpapahaba - bawasan ang pagkakataon ng mahinang mga bono ng hydrogen;
· Bawasan ang konsentrasyon ng panimulang aklat – bawasan ang pagkakataong magbigkis ng mga redundant na primer at hindi target na mga rehiyon;
Mababang kahusayan ng amplification
Ang kabaligtaran ng sitwasyon sa hindi partikular na amplification – mababang kahusayan sa amplification , at ang mga hakbang upang harapin ang mababang kahusayan sa amplification ay kabaligtaran lamang:
· Pahabain ang oras ng pagsusubo at pagpahaba;
· Baguhin sa tatlong-hakbang na PCR at bawasan ang temperatura ng pagsusubo;
· Taasan ang konsentrasyon ng panimulang aklat;
Ps: Maraming graduate students na ipinanganak noong 90s ay ayaw mag-aral kung paano mag-debug ng mga eksperimento, at umaasa na ang kit ay ganap na malulutas ang problema (kung gusto mong pumunta sa isang reagent company para mag-research at development pagkatapos ng graduation), sa katunayan, ang mga reagent manufacturers ay nag-iisip din ng ganitong paraan, sana ito ay isang tanga Maaari itong magamit kapag nakuha mo ito, kaya ang dami ng mga reagent na pagsisikap upang malutas ang problema, ang mga hindi pag-introduksyon ay nagastos para sa paglutas ng problema. mahina ang H-bond absorption factor.Upang madaling malutas ang problema, kailangan pang basahin ng mga mangmang ang pagpapakilala ng kumpanya ng reagent upang makita kung mayroong isang kadahilanan na sumisipsip ng mahina na mga bono ng hydrogen.
Mahirap pumili ng konsentrasyon ng primer at problema sa mga primer-dimer
Paraan 1: Sa pangkalahatan, ang mga tagubilin sa kit para sa qPCR ay may mga inirerekomendang sistema at inirerekomendang mga panimulang konsentrasyon.
Paraan 2: Pag-debug sa pamamagitan ng pagtatakda ng gradient ng konsentrasyon ng primer.Ang larawan sa ibaba ay ninakaw mula sa isang kumpanya upang ilarawan.Ipinapakita ng figure sa ibaba ang fluorescence quantitative na mga resulta na ginawa gamit ang tatlong primer na gradient ng konsentrasyon (100nM, 250nM, 500nM) at apat na template na gradient ng konsentrasyon (0.1ng, 1ng, 10ng, 100ng).Ang halaga ng Ct ng mga pang-eksperimentong resulta ay naka-plot tulad ng sumusunod:

Pagpili ng Primer Concentration Pagsama-samahin ang bawat primer na konsentrasyon sa isang linya tulad ng sumusunod:

Ang pagpili ng panimulang konsentrasyon ay halata, ang linear na relasyon ng panimulang konsentrasyon ng 100nM at 250nM ay mas mahusay, at ang linear na relasyon ng panimulang konsentrasyon ng 500nM ay medyo mahirap.Sa 100nM at 250nM, ang halaga ng Ct na 250nM ay medyo maliit, kaya ang pinakamainam na konsentrasyon ng primer ay 250nM.Sa pangkalahatan, ang malalang primer-dimer ay makikita sa melting curve.Paano kung hindi maiiwasan ng mga dinisenyong primer ang mga primer-dimer?
Paraan 3: Bawasan ang dami ng mga panimulang aklat at dagdagan ang temperatura ng pagsusubo (hindi na kailangang ipaliwanag).
Ang empirical na halaga ng temperatura ng pagsusubo ay 60°C.Kung hindi ka sigurado, paano pumili ng mas angkop na temperatura ng pagsusubo?Ang sagot ay pareho sa pagpili ng panimulang konsentrasyon -gradient na pagsubok.Kumuha ng larawan mula sa kumpanya ng Bio-rad upang ilarawan ang problema.Para sa amplification ng isang partikular na target na fragment, magtakda ng walong temperatura gradients, bawat isa ay may tatlong pag-uulit, at ang nakuha na amplification curve ay ang mga sumusunod:

pagpili ng temperatura ng pagsusubo:
·70°C, 69°C—Sa pangkalahatan, ang mga primer ay hindi maaaring pagsamahin, kaya walang amplification.
·67.3°C – May maliit na halaga ng amplification sa simula, at medyo malaki ang halaga ng Ct.
·64.5°C——Bumababa ang halaga ng Ct.
·Sa 60.7°C, 58.0°C, 56.2°C, at 55.0°C, ang mga halaga ng Ct ay karaniwang naging stable, ngunit ang mga panghuling halaga ng fluorescence ay iba.
Paano pumili?Prinsipyo: Ang unang prinsipyo ay ang mas mataas na halaga ng Ct.Para sa parehong Ct value, pumili ng mas mataas na annealing temperature para maiwasan ang dimerization at hindi partikular na amplification.Bagama't may mas mataas na halaga ng fluorescence sa 55°C, maaaring mayroong mga dimer o hindi partikular na amplification dito.
Pero kung kasing talino mo, siguradong iisipin mo: Logically speaking, kung very specific ang PCR reaction, basta lumampas ang primer concentration sa minimum requirement, dapat walang effect ang high and low points, gaya ng fluorescent dyes at dNTPs.Sa katunayan, hangga't ang temperatura ng pagsusubo ay na-optimize nang maayos, ang epekto ng panimulang konsentrasyon sa halaga ng Ct ay natural na mababawasan.

Ang temperatura ng pagsusubo ay na-optimize nang maayos, at ang epekto ng panimulang konsentrasyon sa CT ay mababawasan
Ang pangalawang istraktura ay nakakaapekto sa kahusayan ng amplification
Kunan natin ang larawan mula sa Bio-rad upang ilarawan ang problema.Nagdidisenyo din ito ng gradient ng temperatura upang palakasin ang isang gene na may pangalawang istraktura.

Lumilitaw ang pangalawang istraktura
Makikita na habang bumababa ang gradient ng temperatura, nagsisimulang lumitaw ang mga produkto at umuusad ang halaga ng Ct, na umaabot sa pinakamababang halaga sa 60.7°C, at pagkatapos ay habang bumababa ang gradient ng temperatura, nagiging mas malaki ang halaga ng Ct.Sa kabaligtaran, habang tumataas ang temperatura, bubukas ang pangalawang istraktura at tumataas ang kahusayan ng amplification.Matapos maabot ang isang tiyak na temperatura, ang pagtaas ng temperatura ay hindi maaaring mapabuti ang kahusayan ng amplification.Dahil ang mga panimulang aklat ay hindi maaaring stably pinagsama sa oras na ito.Samakatuwid,hanapin ang temperatura na may pinakamababang halaga ng Ct, na kung saan ay ang pinakamahusay na temperatura para sa amplifying ang pangalawang istraktura template!Siyempre, dapat malaman ng mga matalinong tanga na kung hindi kinakailangan, pinakamahusay na baguhin ang mga panimulang aklat at iwasan ang rehiyon ng pangalawang istraktura.
5. Antas ng aplikasyon
MIQE—Pagsusuri ng Datos

Ang pagsusuri ng data ay pangunahing ibinibigay ng fluorescent quantitative PCR instrument.Sa nakaraang artikulo, maraming gawain sa pagsusuri ng data ang nagawa, tulad ng blangkong kontrol, na ipinaliwanag sa disenyo ng eksperimento.Ang mga internal na reference na gene, repeat number, atbp. ay nilinaw., dito namin pangunahing ipinapaliwanag ang aplikasyon ng qPCR.
Malawakang ginagamit ang qPCR, at ang pang-eksperimentong pag-verify at diagnosis ng nucleic acid ay ang pinakakaraniwang ginagamit na mga sitwasyon.
ganap na quantification
Ang log (paunang konsentrasyon) ay may linear na relasyon sa bilang ng mga cycle.Ang isang karaniwang curve ay maaaring iguguhit mula sa isang pamantayan na may kilalang numero ng paunang kopya, iyon ay, ang linear na relasyon ng reaksyon ng amplification ay maaaring makuha.Ayon sa halaga ng Ct ng sample, maaaring kalkulahin ang konsentrasyon sa sample.Ang dami ng mga template na isasama.

Ganap na Dami ng Pagkalkula Paraan
Ang absolute quantification ay dapat na nakabatay sa standard curve.Upang makagawa ng isang karaniwang kurba, kinakailangan ang isang pamantayan.Karaniwan, ang pamantayan ay isang plasmid na nakuha sa pamamagitan ng pag-clone ng target na gene.Bakit ito ay isang plasmid?Dahil ang circular plasmid DNA ay ang pinaka-stable.Dilute ang standard na produkto sa 5 hanggang 6 na gradients ayon sa dobleng ratio (10-fold dilution), at bigyang-pansin ang pagkakapareho kapag diluting.Hayaang mahulog ang halaga ng Ct sa pagitan ng 15-30.

Karaniwang paghahanda
Kasabay nito, ang sample na susuriin ay dapat ding diluted nang naaayon (tandaan ang dilution factor), at ang Ct value ay dapat ding mahulog sa pagitan ng 15-30.Ang karaniwang produkto + ang sample na susuriin ay inilalagay sa makina nang magkasama.Pagkatapos ng run, isang standard curve ang ginawa gamit ang standard substance, at ang mga sample na susuriin ay dinala sa standard curve para kalkulahin ang concentration.
Hepatitis B virus Ang HBV quantification ay isang tipikal na absolute quantification, na maaaring kalkulahin ang virus copy number sa 1ml ng dugo.
Pagkalkula ng numero ng kopya
Sample na konsentrasyon na susuriin (ng/ul) = OD260 × 50ug/ml × dilution factor
Sample na molekular na timbang = bilang ng mga base × 324
Ang numero ng kopya ng sample na susuriin (mga kopya/ul) = ang konsentrasyon ng sample na susuriin / ang molecular weight ng sample × 6 × 1014

Paraan ng pagkalkula ng numero ng kopya

Ang nasa itaas ay ang paraan ng pagkalkula para sa pagtukoy ng dami.Ito ay isang problema sa matematika na maaaring malutas pagkatapos ng pagtatapos mula sa junior high school, at ang mga problema sa matematika ay karaniwang nalulutas ng mga computer.Kung hindi mo maintindihan, maaari kang pumunta upang makipag-usap.
relatibong dami
Ang relatibong dami ay pangunahing ginagamit sa siyentipikong pananaliksik.Gaano karaming mga virus ang mayroon sa 1ml ng dugo, at ito ay isang DNA virus, ito ay isang medyo deterministikong kaganapan: ang dami ng dugo ay maaaring matukoy, at ang DNA virus ay medyo matatag.Gayunpaman, mahirap para sa amin na ihambing ang bilang ng mga kopya ng transkripsyon ng isang partikular na gene sa isang dahon, dahil mahirap matukoy ang laki, timbang, at lambot ng dahon, ang dami ng nakuhang RNA ay mahirap matukoy, at ang kahusayan ng reverse transcription ay mahirap ding matukoy , ibig sabihin, anumang hakbang ay maaaring magkaroon ng mga bug at hindi magagamit ang data ng eksperimental.
Samakatuwid, ang relatibong dami ay dapat magpakilala ng isang elemento:ang panloob na reference gene.
Sa madaling salita, ang kamag-anak na dami ay talagang isang paghahambing sa pagitan ng target na gene at ng panloob na reference gene.Kung ikukumpara sa parehong tissue at sa parehong cell, ang impluwensya ng sample size, RNA extraction amount, reverse transcription efficiency, at PCR efficiency ay medyo maliit.Dahil sa maliit na laki ng sample, ang parehong mga panloob na sangguniang gene at target na mga gene ay medyo nabawasan.Ito ang dahilan kung bakit binibigyang-diin natin ang pagkakapareho at katatagan noon pa man.
Ang mga panloob na sangguniang gene ay karaniwanhousekeeping genes( house-keeping genes), na tumutukoy sa isang klase ng mga gene na matatag na ipinahayag sa lahat ng mga cell, at ang kanilang mga produkto ay kinakailangan upang mapanatili ang mga pangunahing aktibidad sa buhay ng mga cell.
Huwag malito ang konseptong ito.Ang mga housekeeping gene ay biological function terms, habang ang internal reference genes ay pang-eksperimentong teknikal na termino.Kailangang pumasa sa validation ang mga housekeeping genes bago sila mapili bilang internal reference genes.
Halimbawa, pumili kami ng ilang mga housekeeping gene sa figure sa ibaba upang subukan ang kanilang mga antas ng expression sa iba't ibang mga cell ng tissue, at nalaman na ang mga antas ng expression ng β-2-microglobulin ay medyo naiiba mula sa iba pang tatlong mga gene, kaya hindi sila magagamit bilang mga panloob na reference na gene.

Matapos maunawaan ang pag-andar ng pagwawasto ng panloob na reference gene, dalawang algorithm ang nakuha dahil sa pagpapakilala ng panloob na reference gene.
· dobleng karaniwang paraan ng kurba
·2 – △△Ct method (paraan ng paghahambing ng halaga ng CT)
Kung interesado ka sa pag-aaral ng mga species at gene function, mangyaring isuko ang pananaliksik sa mga algorithm at direktang gumamit ng mga formula, o direktang gumamit ng mga makina;kung ikaw ay isang straight na tao sa matematika at engineering, mangyaring huwag mag-atubiling.
double standard na paraan ng kurba
Tukuyin ang target na gene at housekeeping gene ng control sample at ang sample na susuriin sa pamamagitan ng standard curve, at pagkatapos ay kalkulahin ang relative value ayon sa formula ng pagkalkula, na siyang relatibong antas ng expression.
Mga kalamangan: simpleng pagsusuri, medyo simpleng pang-eksperimentong pag-optimize
Disadvantage: Para sa bawat gene, ang bawat pag-ikot ng mga eksperimento ay dapat gumawa ng karaniwang kurba
Aplikasyon: Isa sa dalawang pinakakaraniwang ginagamit at kinikilalang kamag-anak na mga pamamaraan ng dami sa pag-aaral ng regulasyon ng pagpapahayag ng gene
Ang formula ay ang mga sumusunod:

Ang mga halimbawa ay ang mga sumusunod:

Kalkulahin ang kamag-anak na halaga batay sa quantitative na resulta
2 – △△Ct method (paraan ng paghahambing ng halaga ng CT)

Mga Bentahe: Hindi na kailangang gumawa ng karaniwang kurba
Mga disadvantages: Ipinapalagay na ang kahusayan ng amplification ay malapit sa 100%;ang standard deviation ay <5%, at ang standard curve at ang kahusayan sa pagitan ng bawat amplification ay ipinapalagay na pare-pareho;ang pag-optimize ng mga pang-eksperimentong kundisyon ay mas kumplikado.
Aplikasyon: Isa sa dalawang pinakakaraniwang ginagamit at kinikilalang kamag-anak na mga pamamaraan ng dami sa pag-aaral ng regulasyon ng pagpapahayag ng gene

Siyempre, ang kahusayan sa amplification ay kadalasang imposibleng maging perpekto 1. Paraan ng pagwawasto: Kung alam natin na ang target na gene at ang reference na gene ay may parehong kahusayan sa amplification, ngunit ang kahusayan sa amplification ay hindi katumbas ng 1, kung gayon ang 2－△△Ct ay maaaring itama bilang: (1+E )－△△Ct.lification bilang halimbawa ay maaaring iwasto ang pormula sa lc. 1.95－△△Ct
Sa ngayon, natapos na ang nilalaman tungkol sa fluorescent quantitative PCR .